周娟 張艷平 王奇 陳云波 胡英杰

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405

補(bǔ)腎益智顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

周娟 張艷平 王奇 陳云波 胡英杰▲

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405

目的建立補(bǔ)腎益智顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。方法采用薄層色譜法對補(bǔ)腎益智顆粒中的蛇床子、女貞子和制何首烏進(jìn)行定性鑒定，采用高效液相色譜法對其中蛇床子素和2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量進(jìn)行測定。對于蛇床子素，高效液相色譜系統(tǒng)是由Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-水（65∶35）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為322 nm。對于葡萄糖苷，高效液相色譜系統(tǒng)包括C18（250 mm×4.6 mm，5μm)，甲醇-水（30:70）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為320 nm。結(jié)果補(bǔ)腎益智顆粒的蛇床子、女貞子和制何首烏供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；蛇床子素在0.09～1.35μg范圍內(nèi)與峰面積積峰值線性關(guān)系良好（r=0.999 9）。2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）在0.84～3.15μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 9）。平均回收率分別為100.52%和99.75%。結(jié)論建立的質(zhì)控方法簡便，快速，準(zhǔn)確，回收率高，重現(xiàn)性好，可用于補(bǔ)腎益智顆粒的質(zhì)量控制。

補(bǔ)腎益智顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；蛇床子；女貞子；制何首烏；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

補(bǔ)腎益智顆粒是我校臨床藥理研究所研制的中藥新藥，由蛇床子、女貞子、何首烏等7味中藥組方而成，具有補(bǔ)腎益智、益氣養(yǎng)血之功效。通過十幾年的潛心研究，無論在AD細(xì)胞模型的體外機(jī)制實(shí)驗(yàn)中[1-3]，還是阿爾茨海默病大鼠模型的體內(nèi)藥理試驗(yàn)中[4-6]，都很好地證實(shí)了其對治療老年癡呆癥有良好的療效。補(bǔ)腎益智顆粒是有良好臨床應(yīng)用前景的中藥新藥，因此有必要建立規(guī)范的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，此次實(shí)驗(yàn)以復(fù)方中蛇床子、女貞子、何首烏為目標(biāo)藥材，選取蛇床子中蛇床子素、女貞子中齊墩果酸、何首烏中二苯乙烯苷為指標(biāo)成分，參照《中國藥典》2010年版，建立制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安高效液相色譜儀（泵，P680；檢測器，PDA-100；進(jìn)樣器，Ultimate3000；柱溫箱，TCC-100；工作站，Chromeleon）；色譜柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）。Sartorius萬分之一電子分析天平（BS224S）。

1.2 試藥

中藥化學(xué)對照品和對照藥材由中國藥品生物制品檢定所提供；包括蛇床子素（批號110822-200407）、齊墩果酸（批號111575-200502）、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：10844-201009）、何首烏對照藥材（批號：120934-201009）乙腈及甲醇為色譜純（DIKMA TECHNOLIGIC INC.），水為自制超純水；其他試劑均為分析純。補(bǔ)腎益智顆粒（批號：20120123、20120126）及藥材陰性對照樣品（按處方除去該被測藥材后同法制劑）為自制。

1.3 供試樣品

取本品研細(xì)粉，稱重，加100倍量50%甲醇，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）1 h，離心，取上清液減壓蒸除甲醇，繼續(xù)蒸發(fā)制成水煎濃縮液（1 mL=1 g藥材），即為本品濃縮液。

2 方法與結(jié)果[7]

2.1 藥材的TLC鑒別

2.1.1 蛇床子

2.1.1.1 供試品液制備取本品濃縮液2mL，加水稀釋至10mL，加石油醚，振搖提取3次，每次10 mL，合并石油醚液，減壓蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，即得。

2.1.1.2 對照品液制備取蛇床子素對照品適量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，即得。

2.1.1.3 陰性對照品液制備取缺蛇床子的本品水煎濃縮液，按“2.1.1.1”項(xiàng)下方法制備成陰性對照品液。

2.1.1.4 薄層色譜鑒別吸取供試品液、對照品液和陰性對照品液各5μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠GF薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-環(huán)己烷（3∶2∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈波長365 nm下檢測。結(jié)果，供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同熒光的斑點(diǎn)，陰性樣無干擾。見圖1。

2.1.2 女貞子

2.1.2.1 供試品液的制備取“2.1.1.1”項(xiàng)下石油醚的萃余相，加二氯甲烷振搖提取3次，每次10mL，合并二氯甲烷液，減壓蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，即得。

2.1.2.2 對照品液的制備取齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，即得。

2.1.2.3 陰性對照品液的制備取缺女貞子的本品水煎濃縮液，按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制備成陰性對照品溶液。

2.1.2.4 薄層色譜鑒別吸取供試品液、對照品液和陰性對照品液各5μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色。結(jié)果供試品色譜中，在與齊墩果酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣無干擾。見圖2。

2.1.3 制何首烏

2.1.3.1 供試品液的制備取“2.1.2.1”項(xiàng)下二氯甲烷的萃余相，加正丁醇振搖提取3次，每次10mL，合并正丁醇部位，減壓蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，即得。

2.1.3.2 對照品溶液的制備取何首烏對照藥材粉末0.25 g加甲醇50 mL，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）0.5 h，過濾，洗滌殘?jiān)?，合并濾液，減壓濃縮，殘留液加乙醇定容至2mL，即得。

2.1.3.3 陰性對照品溶液的制備取缺何首烏子的本品水煎濃縮液，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備成陰性對照品溶液。

2.1.3.4 薄層色譜鑒別吸取供試品液、對照品液和陰性對照品液各5μL，分別點(diǎn)于同一塊羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以甲苯-乙醇（4∶2.5）為展開劑，展開約4 cm取出，晾干；再以甲苯-乙醇（4∶0.8）為展開劑，展至約7 cm，至紫外光燈波長365 nm下顯熒光斑點(diǎn)。結(jié)果，供試品色譜中，在與何首烏對照藥材對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。見圖3。

2.2 含量測定

2.2.1 蛇床子素的含量測定

2.2.1.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm， 5μm）；流動相為乙腈-水（65∶35）；檢測波長為322 nm。理論板數(shù)按蛇床子素峰計(jì)算，應(yīng)不低于4 000。見圖4。

2.2.1.2 對照品溶液的制備取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含45μg的溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液的制備精密吸取本品濃縮液5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇至刻度，精密稱定，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）30min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.4 陰性對照品液制備取缺蛇床子的本品水煎濃縮液，按“2.2.1.3”項(xiàng)下方法制備成陰性對照品液。

2.2.1.5 線性關(guān)系考察分別吸取對照品溶液2、4、6、8、10、15、20、25、30μL，注入色譜儀并記錄色譜圖，將進(jìn)樣量與峰面積進(jìn)行回歸處理，得回歸方程為：A=108.116 3X-2.765 3，r=0.999 9。結(jié)果表明蛇床子素在0.09～1.35μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.1.6 精密度試驗(yàn)取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD為0.32%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)精密吸取同批供試品6份（批號：20120126），測定。結(jié)果含量為0.188 1mg/g，RSD為1.5%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)分別于0、2、4、6、8、12 h精密吸取供試品（批號：20120123）溶液10μL，進(jìn)樣，測定蛇床子素的峰面積，結(jié)果峰面積RSD為0.99%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量（蛇床子素0.172 9mg/g）的補(bǔ)腎益智方濃縮液（批號：20120126）9份，各2.5 mL，按低、中、高質(zhì)量濃度分別精密加入蛇床子素（相當(dāng)于0.35、0.45、0.52 mg），每個(gè)濃度3份，依法制備供試液，測定，蛇床子素的回收率為100.52%，RSD為1.7%，表明方法回收率良好。見表1。

表1 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

2.2.1.10 樣品含量測定取供試品兩批制成供試品溶液，取供試品溶液10μL，依法測定，結(jié)果兩批樣品中蛇床子素含量。見表2。

表2 樣品蛇床子素含量測定結(jié)果（±s，n=3）

表2 樣品蛇床子素含量測定結(jié)果（±s，n=3）

批號蛇床子素（mg/g）RSD（%）20120123 20120126 0.190±0.004 0.180±0.003 2.3 1.9

2.2.2 二苯乙烯苷的含量測定

2.2.2.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex LunaC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-水（25∶75）；檢測波長為320 nm。理論板數(shù)按二苯乙烯苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。避光操作。見圖5。2.2.2.2對照品溶液的制備取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.2mg的溶液，即得。

2.2.2.3 供試品溶液的制備取蛇床子測定項(xiàng)下的供試品溶液，即得。

2.2.2.4 陰性對照品液制備取缺制何首烏的本品水煎濃縮液，按“2.2.2.3”項(xiàng)下方法制備成陰性對照品液。

2.2.2.5 線性關(guān)系考察分別吸取對照品溶液4、6、8、10、12、15μL，注入色譜儀并記錄色譜圖，將進(jìn)樣量與峰面積進(jìn)行回歸處理，回歸方程為：A=23.318 7X+32.994 7，r=0.999 9。結(jié)果表明二苯乙烯苷在0.84～3.15μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.2.6 精密度試驗(yàn)取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，RSD為0.32%，說明進(jìn)樣精密度良好。

2.2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同批供試品5份（批號：20120123），測定。結(jié)果含量為1.88 mg/mL，RSD為1.3%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量二苯乙烯苷1.88mg/g的補(bǔ)腎益智顆粒（批號：20120123）濃縮液9份，各2.5mL，按低、中、高質(zhì)量濃度分別精密加入二苯乙烯苷（相當(dāng)于1.8、2.0、 2.5mg），每個(gè)濃度3份，依法制備供試液，測定，二苯乙烯苷的回收率為99.75%，RSD為2.1%，表明方法回收率良好。見表3。

表3 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

2.2.2.9 樣品含量測定取供試品2批制成供試品溶液，取供試品溶液10μL，依法測定，結(jié)果3批樣品中二苯乙烯苷含量。見表4。

表4 樣品二苯乙烯苷含量測定結(jié)果（±s，n=3）

表4 樣品二苯乙烯苷含量測定結(jié)果（±s，n=3）

批號二苯乙烯苷（mg/g）RSD（%）20120126 20120223 1.86±0.03 1.89±0.05 1.62 2.70

3 討論

補(bǔ)腎益智顆粒系經(jīng)水提醇沉工藝提取、精制而成。故取其細(xì)粉用含水甲醇進(jìn)行處理，并制成濃縮液用于質(zhì)控方法研究。利用擬定的TLC條件，對蛇床子、女貞子和制何首烏三味藥材進(jìn)行定性鑒別，展開效果良好，斑點(diǎn)清晰。

鑒于蛇床子素可通過影響癡呆型動物模型學(xué)習(xí)記憶能力、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及自由基損傷表現(xiàn)出防治AD的作用[8]；補(bǔ)腎益智方含藥血清能在一定程度上抑制Aβ25-35對細(xì)胞的損傷作用，并且經(jīng)拆方研究發(fā)現(xiàn)以蛇床子為主的補(bǔ)腎組和以何首烏為主的補(bǔ)腎組有不同的藥理作用，且有協(xié)同作用[9-10]，因此選取蛇床子的蛇床子素和制何首烏的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷兩個(gè)成分作為質(zhì)控的指標(biāo)成分，用高效液相色譜法進(jìn)行可能的有效成分定量質(zhì)控方法研究。經(jīng)方法學(xué)考察，證明本研究所建立的含量測定方法具有回收率高、重現(xiàn)性好、簡便、迅速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于補(bǔ)腎益智顆粒質(zhì)量控制。

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Study on quality standard for Bushen YizhiGuanules

ZHOU Juan ZHANG Yanping WANGQi CHEN Yunbo HU Yingjie▲
Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong Province,Guangzhou 510405,China

ObjectiveTo establish a quality standard for Bushen Yizhi Granules.MethodsTLC techniques were used to indentify Cnidii Fructus,Ligustri Lucidi Fructus and Preparata PolygoniMultiflori Radix.The contents of osthole of Cnidii Fructus,and 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(stilbene glycoside)of Preparata Polygoni Multiflori Radixwere both determined by HPLC.For osthole,HPLC system was consisted of Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm, 5μm),acetonitrile-water(65∶35)was used asmobile phase,with the flow rate of 1.0 mL/min,detection wavelength was 322 nm.And for stilbene glucoside,the HPLC system consisted of C18(250mm×4.6mm,5μm),methanol-water(30:70)as mobile phase,flow rate of 1.0 mL/min,detection wavelength at 320 nm.ResultsThe methods of TLC were simple with strong specificity and good reproducibility.The results of HPLC showed that calibration curve was linear in the ranges of 0.09-1.35μg(r=0.999 9)for osthole,and 0.84-3.15μg(r=0.999 9)for stilbene glycoside.The average recovery rate was 100.52%and 99.75%,respectively.ConclusionThemethod established is simple,accurate and suitable for the quality control Bushen YizhiGranuls.

Bushen Yizhi Granules;TLC;HPLC;Cnidii Fructus;Ligustri Lucidi Fructus;Preparata Polygoni Multiflori Radix;Quality standard

R285.5

A

1673-7210（2012）11（c）-0113-04

2010年度高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（項(xiàng)目編號：20104425110014）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2010A030100009）。

周娟（1984-），女，廣州中醫(yī)藥大學(xué)2009級中藥學(xué)碩士研究生。

▲通訊作者

2012-07-09 本文編輯：衛(wèi)軻）