蘭鴻 陳鴻梅

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰 442000

復(fù)方丹參注射液對(duì)大鼠急性脊髓損傷的保護(hù)作用

蘭鴻 陳鴻梅▲

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰 442000

目的觀察復(fù)方丹參注射液對(duì)急性脊髓損傷大鼠的保護(hù)作用。方法采用改良Allen weight dropping（Allen WD）打擊法將42只Wistar大鼠制成脊髓中度損傷模型，分別給予復(fù)方丹參注射液、甲基強(qiáng)的松龍及生理鹽水治療，觀察動(dòng)物不同時(shí)間的神經(jīng)功能評(píng)分、斜板試驗(yàn)及脊髓細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果從傷后2周起，丹參組的神經(jīng)功能評(píng)分和斜板最大角度分別與生理鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。從傷后12 h起，丹參組細(xì)胞凋亡率與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丹參組與甲強(qiáng)龍組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論復(fù)方丹參注射液對(duì)大鼠脊髓損傷細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，能夠達(dá)到治療急性脊髓損傷的作用。

丹參；急性脊髓損傷；大鼠；細(xì)胞凋亡

隨著交通業(yè)和建筑業(yè)的發(fā)展，臨床中急性脊髓損傷（acute spinal cord injury）逐漸增加。急性脊髓損傷具有較高的致殘率，研究表明急性脊髓損傷后二次脊髓打擊程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原發(fā)損傷[1]。臨床中如何避免繼發(fā)性脊髓二次打擊成為治療急性脊髓損傷的關(guān)鍵。雖然文獻(xiàn)中多有報(bào)道急性脊髓損傷后即刻大劑量甲強(qiáng)龍治療方法，但研究發(fā)現(xiàn)甲強(qiáng)龍雖能改善急性脊髓損傷發(fā)展結(jié)果，但有增加相關(guān)并發(fā)癥的可能。近年來有學(xué)者嘗試使用丹參治療急性脊髓損傷的報(bào)道。本文通過實(shí)驗(yàn)初步探討丹參對(duì)急性脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠，42只，體重0.20～0.25 kg，雌雄不限，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（鄂）2005-0031。

丹參注射液（上海中西醫(yī)制藥有限公司）；甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉（美國(guó)Upjohn公司）；細(xì)胞凋亡檢檢測(cè)試劑盒（POD武漢博士德生物工程有限公司）；異氟烷和脂肪乳（黑龍江省集成醫(yī)藥實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 急性脊髓損傷模型制備

將42只Wistar大鼠隨機(jī)分為三組，每組14例：生理鹽水組、丹參組、甲強(qiáng)龍組。將把異氟烷和脂肪乳混合做成乳化異氟烷。制備方法：用30%脂肪乳為載體，室溫下（20℃）應(yīng)用玻璃瓶法，配制8%乳化異氟烷，即將1.2 mL的液態(tài)異氟烷和21.3mL的30%脂肪乳加入至一個(gè)氣密性良好的25～30mL玻璃容器內(nèi)，振蕩器上以2 000 r/min的速度劇烈震蕩30 s，靜置30 s，然后以2 000 r/min速度劇烈震蕩50 min，達(dá)到平衡后置于4℃冰箱中備用。后以0.51～0.64mL/kg腹腔注射，麻醉后采用改良Allen WD打擊法制備ASCI模型。剔除大鼠背部正中毛發(fā)，選擇后正中切口顯露T8-T10椎板，切除椎板過程中注意保護(hù)硬脊膜完整性。將預(yù)備的銅片制成曲度直徑與椎管相似圓形墊片，將墊片放置于硬脊膜表面。將兩頭相通的玻璃試管垂直放置與顯露創(chuàng)面上方，選擇重7.5 g銅錘從高10 cm處通過玻璃試管自由下落，打擊墊片，造成急性脊髓損傷模型，關(guān)閉手術(shù)切口。術(shù)后采用人工擠壓膀胱方法輔助排尿，每日6次。

1.3 給藥方法

大鼠造成急性脊髓損傷后，復(fù)方丹參注射液1.08mg/kg體重，給予腹腔注射，每日1次，共連續(xù)注射7 d；甲強(qiáng)龍15min內(nèi)按照30mg/kg給予腹腔注射，傷后1 h開始，以5.4mg/（kg·h）腹腔注射，共23 h，平均分4次使用。生理鹽水組傷后按照丹參組方法腹腔注射生理鹽水。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

隨機(jī)取4只大鼠，于造模后24 h、2、4、6周，開胸經(jīng)心臟先以生理鹽水灌注，觀察液體變清后，以5%多聚甲醛磷酸液行脊髓灌注，脊髓固定后，通過原切口顯露脊髓并切取損傷階段約5mm，再次以5%多聚甲醛磷酸液浸泡24 h，采用脫水石蠟常規(guī)包埋，連續(xù)切取厚度5μm切片10張，隨機(jī)選取4張切片放入細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，凋亡細(xì)胞核顯微鏡下觀察呈黃色。經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理系分別檢測(cè)出每張切片凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，以凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.5 觀察指標(biāo)

分別于術(shù)后2、4、6周測(cè)量大鼠斜板試驗(yàn)度數(shù)和大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（BBB評(píng)分）。斜板試驗(yàn)[2]：將斜板與大鼠長(zhǎng)軸呈垂直放置，緩慢抬高斜板，每次抬高5°，觀察大鼠能夠在斜板上停留5 s的最大度數(shù)，反復(fù)測(cè)量3次，取平均值，計(jì)算大鼠斜板試驗(yàn)功能值。BBB評(píng)分以Basso等[3]描述的方法為準(zhǔn)，采用盲法原則，有其他人員觀察測(cè)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，丹參組和甲強(qiáng)龍組細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參組與甲強(qiáng)龍組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

組別只數(shù)凋亡指數(shù)24 h 2周4周6周生理鹽水組丹參組甲強(qiáng)龍組444 47.38±4.07 31.45±3.09* 30.94±3.56* 39.41±3.35 24.59±3.18* 25.28±3.41* 31.84±3.62 14.76±3.27* 13.34±3.54* 27.59±3.37 7.46±3.36* 8.23±3.40*

2.2 斜板試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，丹參組和甲強(qiáng)龍組大鼠斜板試驗(yàn)功能值均高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 斜板試驗(yàn)比較（±s，°）

表2 斜板試驗(yàn)比較（±s，°）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

組別只數(shù)最大斜板試驗(yàn)度數(shù)2周4周6周生理鹽水組丹參組甲強(qiáng)龍組10 10 10 19.48±6.56 28.56±5.79* 29.28±5.43* 28.57±5.82 44.68±5.19* 46.78±5.15* 35.75±6.23 54.26±5.42* 55.91±5.84*

2.3 BBB評(píng)分結(jié)果

結(jié)果顯示，丹參組和甲強(qiáng)龍組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（BBB評(píng)分）均高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

研究表明急性脊髓損傷后脊髓受到雙重打擊，首先如外傷導(dǎo)致直接的脊髓壓迫，致使壓迫部位出血、壞死；其次壓迫后若不能及時(shí)解除壓迫脊髓出現(xiàn)、缺血水腫，局部吞噬細(xì)胞、組織因子等炎癥介質(zhì)滲出，缺血等因素激活谷氨酸受體，致具有細(xì)胞毒性物質(zhì)溢出，使脊髓遭受二次打擊，引起細(xì)胞凋亡。二次脊髓打擊是持續(xù)過程，且其過程是可逆的，若臨床中能夠及時(shí)阻斷脊髓二次打擊，可有效阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡和功能退變，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和軸突生長(zhǎng)，有助于脊髓功能恢復(fù)。

表3 BBB評(píng)分比較（±s，分）

表3 BBB評(píng)分比較（±s，分）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

組別只數(shù)BBB評(píng)分2周4周6周生理鹽水組丹參組甲強(qiáng)龍組10 10 10 5.84±0.63 7.16±0.97* 7.78±0.85* 8.07±1.41 12.86±1.24* 13.46±1.57* 9.15±1.67 13.76±1.35* 14.19±1.48*

丹參有效成分為丹參酮，研究表明丹參酮可抑制炎癥一期反應(yīng)中組織胺對(duì)毛細(xì)血管的作用，降低毛細(xì)血管通透性，同時(shí)可以抑制二期炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞通過毛細(xì)血管向組織游走，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)。最近研究表明核因子-κB（NF-κB）通過逆轉(zhuǎn)錄參與多核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)中起到重要作用[4]，汪吉明等[5]研究表明急性創(chuàng)傷性脊髓損傷后，復(fù)方丹參可以抑制NF-κB的活性表達(dá)，對(duì)減輕NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低炎癥介質(zhì)對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。急性脊髓損傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)可激發(fā)血液系統(tǒng)的凝血功能，血液處于高凝狀態(tài)[6]，丹參酮可擴(kuò)張微循環(huán)，增加受損部位神經(jīng)細(xì)胞血供，減緩或抑制細(xì)胞凋亡。余永桂等[7]將急性脊髓損傷模型分為丹參治療組和生理鹽水治療組，結(jié)果顯示丹參組細(xì)胞凋亡數(shù)低于生理鹽水治療組，丹參組bcl-2表達(dá)增高，他們認(rèn)為丹參可能通過“抑制氧自由基脂質(zhì)過氧化、減少細(xì)胞鈣內(nèi)流、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和上調(diào)bcl-2”的作用達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用。本研究中細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明丹參組術(shù)后24 h、2、4、6周細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為（31.45±3.09）、（24.59±3.18）、（14.76±3.27）和（7.46±3.36），低于生理鹽水治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且丹參組細(xì)胞凋亡指數(shù)降低速度大于生理鹽水治療組，說明丹參對(duì)急性脊髓損傷具有治療作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示丹參組大鼠BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)均高于生理鹽水治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），筆者認(rèn)為丹參通過抑制急性脊髓損傷后炎癥反應(yīng)和擴(kuò)張局部微循環(huán)達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡，治療急性脊髓損傷的作用。臨床觀察表明經(jīng)丹參治療患者全血黏度切變值、纖維蛋白原、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞變形指數(shù)均有明顯改善，說明丹參可改善急性脊髓損傷患者末循環(huán)，起到保護(hù)ASCI的作用。

目前臨床中多使用大劑量甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉沖擊治療急性脊髓損傷，研究顯示甲強(qiáng)龍可減輕急性脊髓損傷后脊髓水腫、炎癥反應(yīng)等繼發(fā)脊髓損傷，達(dá)到治療作用。本研究中發(fā)現(xiàn)丹參治療組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)、BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)與甲強(qiáng)龍組相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明丹參對(duì)脊髓繼發(fā)損傷的治療作用與甲強(qiáng)龍相似。文獻(xiàn)報(bào)道大劑量甲強(qiáng)龍沖擊治療可引起較多并發(fā)癥，限制了甲強(qiáng)龍的應(yīng)用。故筆者認(rèn)為丹參可替代甲強(qiáng)龍用于治療急性脊髓損傷。

本實(shí)驗(yàn)為丹參應(yīng)用治療急性脊髓損傷提供了理論依據(jù)，但本研究未涉及分子機(jī)制，以后研究中有待于對(duì)丹參治療急性脊髓損傷的分子機(jī)制做進(jìn)一步探討。

[1]Beulter B.Toll-like receptor：how they work and what they do[J].Curr Opin Hematol，2002，（9）：2.

[2]楊挺，蔣贊利，茅祖斌.血塞通聯(lián)合復(fù)方丹參注射液對(duì)大鼠急性脊髓損傷的治療作用及其機(jī)制的初步研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥，2010，38（2）：129-132.

[3]Basso DM，Beattiem S，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale foropen-field testing in rats[J].J Neurotrauma，1995，12（1）：1-21.

[4]叢斌，凌亦凌，谷振勇，等.八肽膽囊收縮素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺組織NF-κB活性增高的抑制作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2000，16（10）：991.

[5]汪吉明，孔抗美，齊偉力，等.復(fù)方丹參對(duì)大鼠急性脊髓損傷后核因子-κB活性的影響[J].中國(guó)骨與關(guān)節(jié)損傷，2007，22（4）：307-309.

[6]許健強(qiáng)，張慶俊.脊髓損傷后的高凝狀態(tài)[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志，2002，12（6）：422-423

[7]余永桂，張功禮，施永彥，等.丹參注射液椎管內(nèi)局部灌注對(duì)急性脊髓損傷的保護(hù)作用[J].中華試驗(yàn)外科雜志，2004，21（8）：993-994.

Protective affect of Com pound Danshen Injection for rats w ith acute spinal cord injury

LAN Hong CHEN Hongmei▲
Departmentof Pharmacy,Taihe Hospital Affiliated to HubeiUniversity ofMedicine,HubeiProvince,Shiyan 442000,China

ObjectiveTo observe the protective affect of Compound Danshen Injection for rats with acute spinal cord injury.MethodsThe ratswere established themodel ofmoderate spinal cord injury by amodification of Allen weight dropping(Allen WD)method and treated with Compound Danshen Injection,Methylprednisolone and physiological saline,respectively,as treatment.Neurological functions were evaluated by using Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores,and the angle of clivus test and cell apoptosiswere performed at 12 h after injury.ResultsThere were significant differences(all P＜0.05)in BBB scores and angle of clivus test between Danshen group and control group from the second week.There were significant differences(P＜0.05)in cell apoptosis between Danshen group and control group from the lst hour.There was no significant differences between Danshen group and Methylprednisolone grorp(P＞0.05).ConclusionCompound Danshen Injection has a protective effect on cell apoplosis of ratswith acute spinal cord injury.

Danshen;Acute spinal cord injury;Rats;Cell apoptosis

R683.2

A

1673-7210（2012）11（c）-0111-03

▲通訊作者

2012-06-12 本文編輯：衛(wèi)軻）