張曙光 何 躍 項(xiàng) 杰 馬林昆 李 燕 袁援生

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的眼部并發(fā)癥，是DM患者致盲的主要原因之一。多年來，國內(nèi)外對DR的研究主要集中在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管微循環(huán)的改變上，對視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的研究較少。事實(shí)上，視網(wǎng)膜是由血管和神經(jīng)元組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，主要由神經(jīng)網(wǎng)膜組成，神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)網(wǎng)膜的主要成分，血管組織僅占很少一部分。20世紀(jì)80年代中期已有學(xué)者提出DR的主要發(fā)病機(jī)理可能不僅是視網(wǎng)膜血管本身，還與血管周圍的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)組織相關(guān)，且關(guān)系更為密切。因此，神經(jīng)網(wǎng)膜的研究對早期DR的預(yù)防及減少其并發(fā)癥的發(fā)生具有重要價(jià)值，阻斷并減少早期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，研究其在DR中的凋亡機(jī)制，對疾病的認(rèn)識和早期治療具有重要意義。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，它是參與凋亡過程的重要基因之一[1-3]，其在DM中的作用也日益受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過觀察JNK2在DM早期視網(wǎng)膜中的表達(dá)變化及其對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響，初步探討JNK2在糖尿病視網(wǎng)膜中的作用及與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為進(jìn)一步了解DM早期視網(wǎng)膜組織的變化奠定基礎(chǔ)，從而為預(yù)防早期DR的發(fā)生及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，檸檬酸、檸檬酸鈉、雅培安妥超越血糖試紙(美國GBI公司)，Trizol(美國Trireagent公司)，cDNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)，2×PCR master mix(美國Fermentas公司)，TBE Buffer、瓊脂糖、基因表達(dá)試劑盒(美國ABI公司)，Taqman基因表達(dá)預(yù)混試劑盒 (美國ABI公司)，GAPDH、JNK2引物(上海生工)，DNA Loading buffer(美國 Fermentas公司)，凋亡試劑盒(Millipore公司)，蛋白酶K(大連寶生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取 6～8周雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由重慶動物實(shí)驗(yàn)中心提供，粗顆粒飼料，清潔水喂養(yǎng)，室溫控制在15～25℃，在無特定病原體的環(huán)境下飼養(yǎng)，隨機(jī)分為正常組18只和DM組42只。

1.2.2 動物模型的建立及血糖測定 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h以上，按150 mg·kg-1體質(zhì)量的劑量，一次性快速腹腔注射新鮮配制的5 g·L-1STZ緩沖液(用 pH 值4.4 的0.1 mol·L-1無菌檸檬酸緩沖液配制)，正常組腹腔注射同體積的0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH值4.4)。造模后3 d，在小鼠禁食12 h后測尾靜脈血糖，空腹血糖＞11.1 mmol·L-1為造模成功，同時(shí)觀察體質(zhì)量及尿量變化。未達(dá)到血糖標(biāo)準(zhǔn)的小鼠及實(shí)驗(yàn)過程中血糖降低者不作為實(shí)驗(yàn)組對象。正常組和DM組小鼠在造模后2周、4周、8周時(shí)分別行尾靜脈采血測空腹血糖，其中正常組分別為(8.25 ±1.05)mmol·L-1、(7.73 ± 1.49)mmol·L-1、(7.33 ± 0.96)mmol·L-1，DM 組分別為(24.94 ± 2.43)mmol·L-1、(23.36 ± 3.63)mmol·L-1、(21.18 ± 5.92)mmol·L-1。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 于造模后2周、4周、8周分別處死正常組小鼠6只，DM組小鼠14只，并取雙眼眼球置于液氮中備用。在液氮中取出各組小鼠左眼眼球，高倍顯微鏡下完整取出視網(wǎng)膜后，采用Trizol試劑提取視網(wǎng)膜中的總RNA，用紫外分光光度儀測OD260及OD280值，同時(shí)取出部分RNA用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測純度是否有降解。本實(shí)驗(yàn)的視網(wǎng)膜總RNA鑒定結(jié)果均證明其條帶完整。取RNA，按照cDNA合成試劑盒說明合成cDNA，并檢測其可用性。JNK2引物通過Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，盡量減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體的存在，所設(shè)計(jì)引物通過Blast軟件檢測其產(chǎn)物正確，內(nèi)參照基因GAPDH由美國Fermentas公司設(shè)計(jì)生產(chǎn)，JNK2引物序列:上游 5’-TTGATACAGTTCTTGGGATA-3’，下游5’-TTGAGGGTACAGTCTGATTT-3’，產(chǎn)物 367 bp;內(nèi)參照基因GAPDH序列:上游5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下 游 5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’，產(chǎn)物 496 bp。Taqman探針由美國ABI公司設(shè)計(jì)合成，實(shí)時(shí)定量反應(yīng)體系20 μL，使用ABI公司的7300PCR熒光定量擴(kuò)增儀進(jìn)行。擴(kuò)增條件:50℃ 2 min，循環(huán)1次;95℃ 10 min，循環(huán)1次;95℃ 15 s，循環(huán)40次;60℃ 1 min，循環(huán)40次。實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果以Ct值顯示，基因表達(dá)的差異采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.2.4 TUNEL染色 取小鼠右眼做冰凍切片，以視神經(jīng)軸為中心，做連續(xù)矢狀切面，切片厚度5 μm，每個(gè)眼球切2-3張片，每張切片取3個(gè)截面，并用40 g·L-1多聚甲醛(pH=7.4)室溫下固定，按TUNEL凋亡試劑盒說明進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)立陽性及陰性對照組，以提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。TUNEL染色后每個(gè)視網(wǎng)膜標(biāo)本取2張切片，光學(xué)顯微鏡下觀察切片，細(xì)胞核呈棕黃色、棕褐色著染者為陽性，細(xì)胞核呈綠色著染者為陰性。200倍光學(xué)顯微鏡下連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)視野100個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)和染色為陽性的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 HE染色 冰凍切片經(jīng)福爾馬林固定，蒸餾水漂洗，蘇木素及伊紅染色并經(jīng)不同濃度的乙醇脫水后二甲苯固定，中性樹膠封片，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的變化，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)為每高倍顯微鏡視野下所看到的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較如符合正態(tài)分布用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，如不符合采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較用單因素方差分析，如方差分析有差異，兩兩之間比較用Bonferroni檢驗(yàn)，如方差不齊采用多個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)(H檢驗(yàn))。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果 GAPDH和JNK2的擴(kuò)增曲線均呈S型，顯示擴(kuò)增效果良好。不同時(shí)間點(diǎn)正常組和DM組JNK2基因表達(dá)水平見表1。由表1知，JNK2在正常組隨時(shí)間延長無明顯變化(P＞0.05)，而在DM組隨時(shí)間延長上調(diào)倍數(shù)顯著增加(P ＜0.05)。

2.2 TUNEL染色結(jié)果 凋亡陽性細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞漿染色呈棕黃色，陰性細(xì)胞因甲基綠染色細(xì)胞核呈綠色。結(jié)果顯示，正常組小鼠視網(wǎng)膜各層內(nèi)可見少量神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡;DM組4周時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見少量的凋亡細(xì)胞，8周時(shí)凋亡細(xì)胞明顯增多，內(nèi)核層和外核層也可見凋亡細(xì)胞(圖1)。不同時(shí)間點(diǎn)正常組和DM組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率情況見表2。由表2知，正常組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡率隨時(shí)間延長無明顯變化(P＞0.05)，DM組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡率隨時(shí)間延長明顯增加(P＜0.05)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組JNK2基因表達(dá)水平Table 1 JNK2 gene expression in two groups at different time points (ρ/g·L-1)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)兩組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率Table 2 Retinal ganglion cell apoptosis rate in two groups at different time points (apoptosis rate/%)

Figure 1 TUNEL staining of each retinal layer in DM group at different time points(×200).A:2 weeks;B:4 weeks;C:8 weeks 不同時(shí)間點(diǎn)DM組小鼠視網(wǎng)膜各層的TUNEL染色結(jié)果(×200)。A:2周;B:4周;C:8周

2.3 HE染色結(jié)果 正常組小鼠可見視網(wǎng)膜分層清晰，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列整齊，內(nèi)叢狀層染色較均勻，內(nèi)核層和外核層細(xì)胞排列較整齊。DM組小鼠在建模后4周時(shí)與正常組比較視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，視網(wǎng)膜分層稍紊亂，細(xì)胞形態(tài)正常，但較稀疏;8周時(shí)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少較明顯，神經(jīng)纖維層及內(nèi)叢狀層變薄，內(nèi)核層細(xì)胞排列較紊亂，外叢狀層厚度亦變薄(圖2)。兩組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)情況見表3。由表3知，正常組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長無明顯變化(P＞0.05)，DM組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長逐漸減少(P＜0.05)。

Figure 2 HE staining of each retinal layer in DM group at different time points(×200).A:2 weeks;B:4 weeks;C:8 weeks 不同時(shí)間點(diǎn)DM組小鼠視網(wǎng)膜各層的HE染色結(jié)果(×200)。A:2周;B:4周;C:8周

表3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組每高倍視野神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)Table 3 Retinal ganglion cell number in two groups at different time points under high power field

3 討論

JNK2是絲裂原激活蛋白激酶家族成員之一，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[4-5]，在不同的應(yīng)激環(huán)境中，JNK2可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6-7]，也可抑制細(xì)胞凋亡[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，JNK2在DM病程中扮演著重要角色。Jaeschke等[9]通過建立自身免疫性DM的非肥胖型小鼠模型來研究JNK2在DM中所扮演的角色，發(fā)現(xiàn)JNK2在該類小鼠CD4+T細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，JNK2基因敲除可提高β細(xì)胞對凋亡的抵抗，減少胰島的破壞，延緩DM的疾病進(jìn)展;Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)在 C57BL/6 DM 小鼠，JNK2的表達(dá)增加能夠激活胚胎細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致畸胎的發(fā)生;Ijaz等[11]研究發(fā)現(xiàn)在DM小鼠中敲除JNK2能夠增加胰島素的靈敏度，降低尿蛋白水平等。

DR是DM的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，阻斷JNK2能夠增加胰島素的敏感性，從而延緩DM的發(fā)展[9]，然而，JNK2在DM小鼠視網(wǎng)膜中的研究國內(nèi)外均未查見報(bào)道。我們通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)在DM小鼠視網(wǎng)膜中同樣存在JNK2的表達(dá)，DM組小鼠與正常組小鼠相比，隨DM病程的延長，JNK2的表達(dá)上調(diào)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率相應(yīng)增加，推測JNK2可能參與了小鼠早期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程，且有促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。

總之，盡管DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但JNK2作為參與凋亡的因素之一，對DM患者如阻斷JNK2途徑，就有可能控制或逆轉(zhuǎn)DR的發(fā)展，JNK2抑制劑的研究有可能成為DR治療的新途徑，但是隨著DR病程的進(jìn)展，JNK2的表達(dá)量是否會繼續(xù)上調(diào)，具體作用機(jī)制如何，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用除了JNK2外是否還存在其他因子參與，JNK2與這些因子之間的關(guān)系等，仍有待于我們進(jìn)一步研究。

1 Jung TW，Lee YJ，Kim SM，Jung TW.Metformin prevents thapsigargin-induced apoptosis via inhibition of c-jun NH2terminal kinase in NIT-1 cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，11(23):921-927.

2 Choi HK，Chung KC.Dyrk1A positively stimulates ASK1-JNK signaling pathway during apoptotic cell death[J].Exp Neurobiol，2011，20(1):35-44.

3 Speicher T，K?hler UA，Chouker A，Werner S，Weiland T，Wendel A.Fructose protects murine hepatocytes from TNF-induced apoptosis by modulating JNK signaling[J].J Biol Chem ，2012，287(3):1837-1846.

4 Oleinik NV，Krupenko NI，Krupenko SA.Cooperation between JNK1 and JNK2 in activation of p53 apoptotic pathway[J].Oncogene，2007，26(51):7222-7230.

5 Ahmed SU，Milner J.Basal cancer cell survival involves JNK2 suppression of a novel JNK1/c-Jun/Bcl-3 apoptotic network[J].PLoS One，2009，4(10):e7305.

6 Rozo AV，Vijayvargia R，Weiss HR，Ruan H.Silencing Jnk1 and Jnk2 accelerates basal lipolysis and promotes fatty acid re-esterification in mouse adipocytes[J].Diabetologia，2008，51(8):1493-1504.

7 Xia HH，He H，Wang J，Gu Q，Lin MC，Zou B，et al.Induction of apoptosis and cell cycle arrest by a specific c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)inhibitor，SP-600125，in gastrointestinal cancers[J].Cancer Lett，2006，241(2):268-274.

8 Waetzig V，Wacker U，Haeusgen W，Bj?rkblom B，Courtney MJ，Coffey ET，et al.Concurrent protective and destructive signaling of JNK2 in neuroblastoma cells[J].Cell Signal，2009，21(6):873-880.

9 Jaeschke A，Rincon M Doran B，Reilly J，Neuberg D，Greiner DL，et al，Disruption of the Jnk2(Mapk9)gene reduces destructive insulitis and diabetes in a mouse model of type I diabetes[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(19):6931-6935.

10 Yang P，Zhao Z，Reece EA.Activation of oxidative stress signaling that is implicated in apoptosis with a mouse model of diabetic embryopathy[J].Am J Obstet Gynecol，2008，198(1):1-7.

11 Ijaz A，Teiada T，Catanuto P，Xia X，Elliot SJ，Lenz O，et al，Inhibition of C-jun N-terminal kinase improves insulin sensitivity but worsens albuminuria in experimental diabetes[J].Kidney Int，2009，75(4):381-388.