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        對苦杏仁燀炒炮制意義的商榷

        2012-11-13 06:31:12陳俊怡賈天柱
        亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2012年6期
        關(guān)鍵詞:炮制制品供試

        陳俊怡,賈天柱,2*

        (1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 大連116600;2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連116600)

        苦杏仁為薔薇科植物山杏(Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.)、西伯利亞杏(Prunus Sibirica L.)、東北杏(Prunus mandshurica Koehne)、杏(Prunus armeniaca L.)的干燥成熟種子[1],具有降氣止咳、平喘、潤腸通便的作用??嘈尤逝谥品椒v史悠久,初見于漢代《金匱要略》去皮尖炒;《雷公炮炙論》有“沸湯浸少時去皮膜”,此應(yīng)為燀法的開始?!锻馀_秘要》有“麩炒”等記載[2]。《中國藥典》從1963年版開始收載苦杏仁的燀法炮制,到1977年版只收生苦杏仁,從1985年版至2010版藥典一部苦杏仁的炮制均為燀苦杏仁和燀炒苦杏仁??嘈尤手饕煞譃橹居秃涂嘈尤受眨谶m宜條件下,如水浸、受潮等條件下,苦杏仁苷會被共存的苦杏仁苷酶水解,產(chǎn)生氫氰酸,大量氫氰酸可麻痹呼吸導(dǎo)致中毒,甚至死亡,所以苦杏仁不能過量使用。臨床應(yīng)用時,苦杏仁必須炮制,以達(dá)到殺酶保苷的目的[3]。其炮制方法有干熱法和濕熱法,如炒法、燀法、燀炒法、蒸法等。所有炮制方法都以最大限度地破壞酶的活性、最大限度地保留苦杏仁苷的含量為考察指標(biāo)。無論哪一種炮制方法,只要是加熱,都能很好地達(dá)到殺酶保苷的作用。燀后再炒,多帶有焦斑,使白苦杏仁變得黑黢黢,不但表觀難看,還會造成能源、資源的浪費(fèi)。但也有人認(rèn)為苦杏仁燀后再炒能更好地殺酶,并降低毒性。那么燀后再炒的實(shí)際炮制效果到底如何,殺酶保苷作用能否更強(qiáng),以及能否明顯降低其毒性,我們對此進(jìn)行了相關(guān)研究。

        1 儀器、試藥與動物

        1.1 儀器

        鐵研船;島津LC-10Tvp高效液相色譜儀、SPD-10AVP紫外檢測器(日本島津)、N2000色譜工作站;KQ-250型超聲清洗器(昆山市儀器有限公司);Sarto-rius Dp225D型電子天平;101型恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);微波爐(格蘭仕 G80F20CN2L-B8);LXJ-84-01型離心機(jī)(北京醫(yī)療儀器修理廠);注射器,灌胃針。

        1.2 試劑

        苦味酸鈉試紙,氫氧化鈉溶液,硫酸亞鐵溶液,稀鹽酸,三氯化鐵試液。分析純甲醇,色譜純甲醇,磷酸(天津科密歐試劑開發(fā)中心)。苦杏仁苷對照品購自上海源葉生物有限公司,經(jīng)HPLC法測定純度>98.5%。藥材:苦杏仁購于安國藥材市場,對照藥典由性狀和苦杏仁苷含量鑒定為薔薇科植物杏(Prunus armeniaca L.)的干燥成熟種子。

        1.3 動物

        昆明種小鼠(18~22g)購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心,合格證號SCKK(遼)2008-0002。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 炮制品制備

        生苦杏仁:取原藥材,除去雜質(zhì)、殘留的核殼及褐色油粒;炒苦杏仁:取凈苦杏仁50g,投入以溫度計測量鍋底溫度為130℃~140℃的鐵鍋內(nèi),炒7min至有爆鳴聲,除去種皮表面呈微黃色,斷面淡黃色,有香氣時,取出放涼。燀苦杏仁:取凈苦杏仁50g,置500mL沸水中,加熱煮約5min,至膨脹,種皮易脫落時,撈出,置冷水稍浸,立即取出,搓去種皮,干燥,篩去種皮[4]。燀炒苦杏仁:取干燥的燀苦杏仁50g,置鍋內(nèi),125℃~135℃炒約5min至表面微黃色,有香氣時,取出放涼。蒸苦杏仁:取凈苦杏仁50g,置蒸鍋內(nèi),厚度掌握在2cm以下,流通蒸汽加熱45min,取出,去皮,干燥。以上炮制品均平行制備3份。

        2.2 苦杏仁酶活性檢驗

        苦味酸鈉試驗:分別取以上5種炮制品,粉碎(粉末過2號篩),取0.5g,置試管中,加水?dāng)?shù)滴使之濕潤,在試管口懸掛一條苦味酸鈉試紙,管口用軟木塞塞緊,將試管置40℃~50℃水浴中加熱,數(shù)分鐘后,若樣品中仍殘留苦杏仁苷酶,則苦杏仁苷水解釋放出氧氰酸,與苦味酸鈉作用,使試紙由橙黃色變成磚紅色。普魯士藍(lán)試驗:分別取以上6種炮制品,粉碎(粉末過2號篩),取0.8g,置試管中,加水濕潤,立即用氫氧化鈉溶液濕潤的試紙將管口包緊,置40℃~50℃水浴中加熱,在濾紙上加硫酸亞鐵溶液1滴、稀鹽酸1滴、三氯化鐵試液1滴,觀察30min內(nèi)濾紙是否顯藍(lán)色。結(jié)果見表1。

        表1 各炮制品苦杏仁酶活性檢驗結(jié)果

        苦味酸鈉試驗和普魯士藍(lán)試驗均是定性鑒別苦杏仁苷酶解產(chǎn)生的氫氰酸,變色時間的長短和變色程度反應(yīng)了氫氰酸的釋放速度和釋放量。氫氰酸的釋放速度和釋放量與酶的含量正相關(guān)。定性鑒別結(jié)果顯示,生品中酶的活性最強(qiáng),最先變色;而在優(yōu)選條件下的各炮制品,均能將苦杏仁酶較完全滅活。

        2.3 苦杏仁各炮制品苦杏仁苷含量比較

        HPLC色譜條件:色譜柱為agilentCT-18(150mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈-1%磷酸水溶液(20∶80),流速為1.0mL/min;柱溫為30℃;檢測波長為210nm;進(jìn)樣體積為10μL。

        2.3.1 對照品溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        精密稱取苦杏仁苷對照品24.01mg,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度。再分別吸取0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL置10mL量瓶中,加甲醇至刻度。分別吸取上述6份對照品溶液各10μL,注入液相色譜儀,分析測定峰面積。以各樣品的濃度(X,mg/mL)對峰面積(Y,mAu)進(jìn)行線性回歸,得回歸方Y(jié)=7465479X-126436,r=0.9997,線性范圍0.048~0.36mg/mL,線性關(guān)系良好。

        2.3.2 供試品溶液的制備

        分別取以上5種炮制品,粉碎(粉末過2號篩),精密稱定約0.25g,置具塞錐形瓶中,加入甲醇40mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30min,放冷,再稱定重量,用甲醇不足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,過0.45μm微孔濾膜,即得。

        2.3.3 方法學(xué)考察

        精密度試驗:取同一供試品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,同上色譜條件測得苦杏仁苷峰面積RSD=1.2%,表明精密度良好。穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液,分別在0、2、4、6、8、10h時進(jìn)樣,同上色譜條件測得苦杏仁苷峰面積RSD=1.2%,表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗:取同一批次藥材,按“2.1”和“2.3.2”項下方法制備6份供試品溶液分別進(jìn)樣,同上色譜條件測得苦杏仁苷峰面積RSD=1.7%,結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性良好。加樣回收率試驗:精密稱取6份已測知含量的供試品各約0.5g,每份添加苦杏仁苷對照品適量,按“2.3.2”項下方法制備并分別進(jìn)樣,同上色譜條件測得苦杏仁苷平均回收率為99.3%,RSD=1.9%,結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確率高。

        2.3.4 含量測定

        抽取各供試品溶液10μL注入液相色譜儀,記錄峰面積,計算苦杏仁苷含量,結(jié)果見表2。

        表2 各炮制品苦杏仁苷百分含量

        2.4 炮制方法對苦杏仁儲藏的影響比較

        在各炮制品密封儲存60天后再次按“2.3.2”項下方法制備并分別注入液相色譜儀,測定含量,結(jié)果見表3。

        表3 儲存后各炮制品苦杏仁苷百分含量

        2.5 急性毒性比較

        2.5.1 供試品制備[6]

        分別取上述5種炮制品粗粉(過二號篩)各50g,分別精密稱定,備用。量取500mL水置鍋內(nèi)加熱至沸,加入苦杏仁粗粉,迅速加熱至沸,保持微沸,煎煮提取30min,稍冷后3層紗布濾過,各藥渣再加水400mL,同上煎煮提取30min,稍冷后3層紗布濾過,輕輕擠壓濾布,使濾液濾盡,合并濾液,減壓濃縮至約20mL,濃縮液3 000r/min離心15min,傾盡上清液,移入25mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,作為急性毒性用藥(每1mL相當(dāng)于苦杏仁炮制品2g)。

        2.5.2 急性毒性試驗方法

        預(yù)試驗給予小鼠生苦杏仁后下水煎液,灌胃前禁食不禁水12h,3只小鼠全死的劑量為48g/kg,3只全不死的劑量8g/kg。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果以35g/kg為最大給藥量,0.7為稀釋系數(shù),分為三個劑量組,每組小鼠雌雄各6只,體重18~22g,每只小鼠0.02mL/g,給藥后觀察7天,記錄其中毒狀況及死亡率。以生苦杏仁給藥量作為參考,給予小鼠炒苦杏仁、燀苦杏仁、燀炒苦杏仁、蒸苦杏仁溶液,以35g/kg為最大給藥劑量,以0.7為稀釋等級系數(shù),給藥方法、觀察指標(biāo)同生苦杏仁水煎液。

        2.5.3 結(jié)果

        小鼠給藥后出現(xiàn)少動、呼吸急促等癥狀,1h左右出現(xiàn)震顫,臥而不動,約4h出現(xiàn)呼吸極弱,最后抽搐掙扎而死亡。多數(shù)死亡小鼠中毒癥狀及時間相似,死亡小鼠解剖各組織均無明顯病理改變。急性毒性LD50和95%的可信度區(qū)間利用統(tǒng)計軟件SPSS根據(jù)Bliss法計算,結(jié)果見表4。組間LD50兩兩比較,燀苦杏仁與燀炒苦杏仁組t檢驗(P<0.01),無統(tǒng)計學(xué)差異,提示燀苦杏仁和燀炒苦杏仁組急性毒性無明顯區(qū)別。

        表4 各炮制品急性毒性LD50和95%的可信度區(qū)

        3 討論

        本文“2.1”采用的各炮制方法,均經(jīng)過查閱文獻(xiàn)和實(shí)際試驗探索,根據(jù)對酶的滅活與有效成分含量的保留優(yōu)選工藝參數(shù)所得到的。由于本文主要研究苦杏仁炮制中燀后炒的意義,其優(yōu)選過程不再列出。在前期的文獻(xiàn)查閱中,有報道[7]說燀苦杏仁在較長時間的儲存后,苦杏仁苷含量會有明顯下降,而燀炒品則不會。因此進(jìn)行了炮制方法對苦杏仁儲藏的影響研究。結(jié)果證明,采用優(yōu)選的工藝參數(shù)分別炮制的燀品與燀炒品,在干燥通風(fēng)處儲存60天后,燀品苦杏仁苷含量的下降程度僅略大于燀炒品。這是燀炒品重復(fù)加熱,酶破壞徹底所致,但無顯著差異,而且其它炮制品如果嚴(yán)格掌握炮制溫度和時間的話也完全可以達(dá)到。

        通過急性毒性試驗,發(fā)現(xiàn)各炮制品急性毒性與供試液中苦杏仁苷含量呈正相關(guān)。炒苦杏仁、燀苦杏仁、燀炒苦杏仁的苦杏仁苷含量差異較小,其對小鼠的半數(shù)致死量LD50也沒有顯著性差異。燀炒品毒性與其他炮制品比較,毒性略低,但也不顯著。其降低原因顯然是因為重復(fù)加熱使苦杏仁苷降低所致??嘈尤手惺欠襁€有除苦杏仁苷外的毒性物質(zhì),還有待進(jìn)一步研究。

        苦杏仁炮制的主要目的就是殺酶保苷,在殺酶的同時,最大程度地保留苦杏仁苷。無論用干熱法還是用濕熱法,均可達(dá)此目的。根據(jù)研究結(jié)果,燀炒苦杏仁使苦杏仁苷降低較多,工藝較繁瑣,造成資源和能源上的浪費(fèi),且外形不美觀,因此建議炮制苦杏仁不采用燀炒法。

        [1]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:187.

        [2]朱衛(wèi)星.中藥苦杏仁炮制的研究概況[J].中國藥業(yè),2007,18(24):1907-1908.

        [3]侯嶸嶠.苦杏仁的炮制原理[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,1997,14(2):130.

        [4]葉定江,張世臣.中藥炮制學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999:583.

        [5]李勉.苦杏仁不同炮制品苦杏仁苷含量測定[J].河南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2006,25(4):44.

        [6]李貴海.不同炮制對苦杏仁毒性及止咳平喘作用的影響[J].中國中藥雜志,2007,32(12):1247-1250.

        [7]閻敏,廖建萍.貯存條件對苦杏仁質(zhì)量的影響[J].中國藥物與臨床,2009,20(1):72-74.

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