李麗波，官國(guó)英，劉中瑞，侯惠仁，梁瑞鵬

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

β2－微球蛋白（β2－microglobin，β2－MG）是人體組織相容抗原（HLA）的一個(gè)β輕鏈，由淋巴細(xì)胞及有核細(xì)胞合成和分泌，相對(duì)分子質(zhì)量為11 800。正常人β2－MG 的合成率及從細(xì)胞膜上的釋放量相對(duì)恒定，β2－MG 可以從腎小球自由濾過，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細(xì)胞中分解破壞，故而正常情況下β2－MG 的排出是很微量的。測(cè)定血清和尿液中的β2－MG可了解腎小球?yàn)V過功能以及腎小管的重吸收功能，是泌尿系統(tǒng)疾病中評(píng)價(jià)腎功能的靈敏指標(biāo)［1］。另外，β2－MG因其能在免疫活性 細(xì)胞的識(shí)別和激活中起主要作用，也是一種腫瘤標(biāo)志物，惡性血液病或其他實(shí)質(zhì)性惡性腫瘤細(xì)胞能合成和分泌β2－MG，且其量超過正常細(xì)胞，使患者血清β2－MG 含量明顯升高。

臨床上血清β2－MG 的檢測(cè)主要有以下幾個(gè)方面的作用［2－5］：1）作為腎臟功能的靈敏指標(biāo)，用于評(píng)價(jià)泌尿系統(tǒng)疾病中腎臟的功能；2）作為反映高血壓和糖尿病腎臟受損的敏感指標(biāo)，動(dòng)態(tài)觀察、診斷早期腎移植排斥反應(yīng)；3）作為一種腫瘤標(biāo)志物輔助診斷惡性腫瘤，評(píng)價(jià)骨髓瘤的預(yù)后及治療效果；4）病毒感染及自身免疫性疾病時(shí)血清β2－MG 會(huì)升高。

目前臨床上檢測(cè)β2－MG 的方法主要有放射免疫分析法（RIA）、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、時(shí)間分辨熒光免疫分析法、免疫透射比濁法及增強(qiáng)免疫比濁法等。其中酶聯(lián)免疫分析法因操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、無放射性污染、儀器設(shè)備價(jià)廉而倍受中小醫(yī)院的青睞。本工作擬采用競(jìng)爭(zhēng)法研制β2－MG 的酶聯(lián)免疫分析試劑盒。

1 主要試劑和儀器

1.1 主要試劑

β2－MG：SCIPAC 公司，辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、脲素過氧化氫（H2O2）：美國(guó)Sigma公司；抗β2－MG 多克隆抗體：原子高科股份有限公司。正常人血清：核工業(yè)401醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。放射免疫分析試劑盒：原子高科股份有限公司。

1.2 主要儀器

SPECTURE酶標(biāo)儀：奧地利SLT公司；GAMMA－C12γ計(jì)數(shù)器：DPC 公司；PYX－DHS－60X75－BS電熱培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 β2－MG 酶標(biāo)記物的制備

采用高碘酸鈉氧化法制備β2－MG 酶標(biāo)記物［6－7］。稱取1.0mg HRP溶于0.1mL 雙蒸水中，攪拌下加入0.1mL新鮮配制的0.06mol／L高碘酸鈉（NaIO4）水溶液，4℃靜置30 min；取出，攪拌下加入0.1mL 0.16mol／L的乙二醇水溶液，室溫下靜置30min。將1.0mg（500μL）β2－MG 的水溶液加入上述溶液中，混勻后，裝入透析袋對(duì)0.05mol／L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液4℃透析過夜。次日，將溶液自透析袋取出，加入0.04 mL 新配制的NaBH4蒸餾水溶液（5g／L），混勻，4℃靜置2h；取出反應(yīng)液，裝入透析袋對(duì)0.02 mol／L pH 7.4 的磷 酸緩沖液4℃透析過夜，取出透析液，加等體積甘油，－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 固相抗體的制備

向聚苯乙烯微量滴定板孔中按每孔200μL滴加含β2－MG 多克隆抗體的pH 9.6碳酸緩沖液，置4℃冰箱內(nèi)過夜，次日取出后置37℃封閉1h，制得酶標(biāo)板，用于免疫反應(yīng)。

2.3 β2－MG 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

用胎牛血清將已知濃度的β2－MG 溶液按要求依次稀釋，配制成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)品，分裝，凍干，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 底物溶液和終止劑

將TMB和H2O2分別溶于pH 5.0檸檬酸－磷酸緩沖液中，使其濃度分別為0.6 和1.2mmol／L，使用時(shí)以體積比1∶1混合即為底物溶液。終止劑為2mol／L H2SO4溶液。

2.5 β2－MG－ELISA分析程序

采取一步法加樣程序：在包被有β2－MG 多克隆抗體的微量滴定板中按每孔20μL 滴加待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和每孔180μL酶標(biāo)記物，混勻，37℃下溫育50 min，棄反應(yīng)液，用含0.05%Tween－20的洗滌液洗5次，再按每孔200μL加入底物液，避光，37℃下顯色15min，以（2mol／L）H2SO4溶液按每孔50μL終止顯色，于450nm處測(cè)定其光密度OD450；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合從而計(jì)算樣品中β2－MG 含量。

3 結(jié)果及討論

3.1 方法學(xué)建立

3.1.1 β2－MG 酶標(biāo)記物（β2－MG－HRP）滴度的選擇 用含0.2%BSA 的磷酸鹽緩沖液將β2－MG－HRP稀釋為1∶12 000、1∶10 000、1∶8 000和1∶6 000的工作液用于β2－MG－ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列于表1。表1 顯示，隨著滴度的增大，各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的OD450也隨之增大，當(dāng)酶標(biāo)記物稀釋度為1∶8 000時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)0.2、5、10mg／L與對(duì)應(yīng)的零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的OD450之比均較大，說明其抑制效果較好，可以滿足免疫分析的要求。因此，選擇酶標(biāo)記物的滴度為1∶8 000。

3.1.2 β2－MG 抗體包被濃度的選擇 β2－MG抗體包被濃度分別為1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0mg／L，進(jìn)行β2－MG 酶免疫分析，選擇最佳β2－MG 抗體包被濃度，結(jié)果列于表2。由表2可知，當(dāng)包 被濃度 為5 mg／L 時(shí)，“0“標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的OD450值適中，加入標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.2mg／L 時(shí)，OD450與零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的OD450之比為76.2%，抑制比較明顯，且此時(shí)抗體用量較少，故選擇抗體包被濃度為5.0mg／L。

表1 β2－MG酶標(biāo)記物（β2－MG－HRP）滴度的選擇

表2 抗體包被濃度的選擇

3.2 方法學(xué)鑒定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度 β2－MG－ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖1。同時(shí)測(cè)定20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)的OD450，以其平均值減去2s計(jì)算其分析靈敏度為0.15mg／L。

圖1 β2－MG ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.2 精密度 重復(fù)測(cè)定3份含有不同β2－MG濃度的人血清樣品，觀察批內(nèi)、批間變異，結(jié)果列于表3。表3顯示，批內(nèi)變異為4.1%～11.2%，批間變異為14.1%～16.0%。

3.2.3 準(zhǔn)確性 取3份不同β2－MG 濃度的人血清樣品分別加入已知濃度的β2－MG 標(biāo)準(zhǔn)品中，測(cè)定β2－MG回收率，結(jié)果列于表4。表4顯示，回收率為93.3%～115.9%。

3.2.4 稀釋實(shí)驗(yàn) 取β2－MG 含量較高的人血清樣品用β2－MG 零標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定結(jié)果列于表5。經(jīng)計(jì)算，稀釋相關(guān)方程為y＝4.279x－0.122 6，相關(guān)系數(shù)r＝0.997 4。

3.2.5 特異性 用零標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)高濃度的甲胎蛋白（α－fetoprotein，AFP）、鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)er）、白蛋白（Albumin，ALB）進(jìn)行系列稀釋（1～10mg／L），并作為樣品在本系統(tǒng)中測(cè)定，結(jié)果列于表6。由表6 可知，F(xiàn)er、ALB 在濃度低于10mg／L時(shí)無明顯交叉反應(yīng)，AFP 在濃度低于5mg／L時(shí)交叉較小。

表3 β2－MG－ELISA 試劑盒的批內(nèi)批間變異

表4 β2－MG－ELISA回收實(shí)驗(yàn)

表5 樣品倍比稀釋實(shí)驗(yàn)

表6 β2－MG ELISA 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

3.3 方法學(xué)比較

與RIA 法同時(shí)測(cè)定59份人血清樣品，測(cè)定的相關(guān)性示于圖2。對(duì)圖2 進(jìn)行線性擬合相關(guān)方程為yELISA＝1.006xRIA＋0.406，r＝0.900。表明本方法與RIA 法具有良好的相關(guān)性。

圖2 本方法與RIA法測(cè)定的相關(guān)性

3.4 正常參考值

檢測(cè)401醫(yī)院檢驗(yàn)科提供的正常人血清樣品100份，測(cè)定結(jié)果低于4.5mg／L。由于所能采集到的樣本數(shù)有限，只進(jìn)行了初步的臨床值測(cè)定，不同地區(qū)、不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過測(cè)定建立自己的正常值參考范圍。

4 小 結(jié)

本試劑盒通過條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，找到合適反應(yīng)體系，建立了β2－MG 酶聯(lián)免疫分析方法，方法分析靈敏度、精密度、檢測(cè)范圍、臨床測(cè)定值達(dá)到免疫分析要求，初步完成了β2－MG－ELISA 試劑盒的研制工作，該試劑盒有望應(yīng)用于臨床。

［1］蔡錫麟，陳耀華，秦明秀.臨床放射免疫學(xué)［M］.北京：原子能出版社，1994：192－195.

［2］陳銀石.β2－微球蛋白檢測(cè)的臨床意義［J］.臨床薈萃，1994，9（20）：941－943.

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［6］郭春祥，郭錫瓊.介紹一種簡(jiǎn)單、快速的辣根過氧化物酶標(biāo)記物酶標(biāo)記抗體的過碘酸鈉法［J］.免疫學(xué)雜志，1983，33：97－100.

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