潘伊微 賈山嶺 潘 輝 賀艷艷 李蓮瑞

(1 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾843300)(2 新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾843300)(3 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

卡拉庫爾羊原產(chǎn)于中亞細亞的荒漠、半荒漠草原，是一種耐嚴寒、酷暑和干旱的大陸性氣候的羔皮羊品種，非常適宜在新疆地區(qū)養(yǎng)殖。其獨特的卷毛在國際市場上享有盛譽，具有良好的經(jīng)濟價值［1］，但近幾年大規(guī)模、高密度的養(yǎng)殖引起一些嚴重疾病的出現(xiàn)，對畜牧養(yǎng)殖提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。

Fas 屬于神經(jīng)生長因子受體/腫瘤壞死因子受體超家族成員，又稱APO－1 或稱CD95 分子，是1989年科學家在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種抗體，這種抗體對人類的細胞具有細胞毒性［2－4］。Fas 是一種細胞凋亡信號的受體，因此亦被稱為死亡分子。細胞凋亡是指細胞程序性死亡，它能夠維持機體的平衡，機體內(nèi)的細胞凋亡機制若是發(fā)生紊亂將會對機體造成極大地損害，目前發(fā)現(xiàn)的死亡受體可以分為三大類，F(xiàn)as 是其中一種死亡受體的代表［5］。

有研究發(fā)現(xiàn)，天然表達或轉(zhuǎn)染表達的Fas 基因?qū)毎蛲鼍写龠M作用，如一些病毒能夠通過誘導T 細胞大量表達Fas，說明Fas 介導的細胞凋亡對T 細胞殺傷和外周T 細胞調(diào)控具有重要作用。Fas抗原作為細胞表面受體，其天然配體可能是某種刺激信號，通過信號傳導最終誘導細胞凋亡，而Fas 抗體正是模擬了配體的這種作用;另外，F(xiàn)as 抗原也可能是某種生長因子受體，而Fas 抗體與之結(jié)合能阻斷其生長因子的作用，因而發(fā)生凋亡［6］。這些研究成果很大程度上激發(fā)了研究者對細胞凋亡致病機理研究的熱情。

目前發(fā)現(xiàn)多種病毒對機體免疫系統(tǒng)中Fas的表達均有影響，證明Fas 在免疫細胞的凋亡過程中起著非常重要的作用。隨著人類的進步，多種新型病毒引起的傳染病在世界范圍內(nèi)迅速傳播，進而要求我們在免疫水平，抗病毒水平上有新的發(fā)現(xiàn)與突破。Fas 作為細胞凋亡的主要途徑之一，理應被重視起來，通過一些分子水平的研究能夠幫助我們了解宿主細胞對外來病原微生物的反應機制，從而為我們提供了新的抗病毒策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株

卡拉庫爾羊由塔里木大學動物科學學院試驗站提供;宿主菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)保存于新疆塔里木大學動物科學學院實驗室。

1.1.2 試劑

低熔點瓊脂糖、Tris－Cl、EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)、Tris－ 甘氨酸緩沖液，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG 購自博奧森、LB 液體培養(yǎng)基、IPTG、SDS－PAGE 電泳所用試劑、2% NaHCO3、弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑。

1.2 方法

1.2.1 包涵體的提取

將目的基因與表達載體連接轉(zhuǎn)化，挑取重組質(zhì)粒pET－28a－Fas的陽性菌接種于5 mL 含有Kana(50 μg/mL)的LB 液體培養(yǎng)基中進行過夜培養(yǎng)。將過夜活化后的細菌以1:500的比例加入到含有Kana(50 μg/mL)的200 mL的LB 液體培養(yǎng)基中，225 rpm 振蕩培養(yǎng)，適時觀察OD600 值，當其達到0.5時，按照表達優(yōu)化過程中得到的最優(yōu)條件進行表達。將大量誘導得到的菌液12 000 r/min，10 min，4℃離心后，收集沉積在管底的菌體，用pH8.0的TE buffer 溶解，渦旋混勻后反復凍融4～5 次，超聲波破碎菌體。破碎過程中應當注意冰浴，防止溫度過高影響提純效果。破碎完成后收集上清和沉淀。

1.2.2 包涵體上清與沉淀的SDS－PAGE、目的蛋白的濃縮

1.2.2.1 將超聲波破碎后收集的上清和沉淀進行SDS－PAGE，經(jīng)染色脫色后將有目的條帶的凝膠與未染色的凝膠比對，將未染色條帶對應區(qū)域切下。

1.2.2.2 電洗脫 參數(shù)設置為電壓70 V，時間2 h;將SDS－PAGE 膠從透析袋中取出，封好透析袋并將其放入PBS(pH 7.2)緩沖液中，4℃透析12 h～24 h，期間換3～4 次緩沖液。

1.2.2.3 用PEG8000 濃縮含有目的蛋白透析帶，將濃縮后的產(chǎn)物收集到離心管中測定濃度后－20℃保存。

1.2.3 融合蛋白Fas的免疫方法、分離抗血清

用核酸蛋白測定儀測得蛋白濃度為0.1 μg/μL，每隔10 d 對兔子進行一次免疫，免疫所用Fas的強度為120 μg/只。每只兔子的注射量為2.4 mL，乳化過程中的混合物配比為蛋白原液:佐劑=1:1。首免:蛋白原液:弗氏完全佐劑=1:1，乳化4 h，免疫采用兩點注射法，免疫部位是兔子的后肢，注射量為，1.2 mL/點。再免:蛋白原液:弗氏不完全佐劑=1:1，乳化4 h，注射方法同首免一樣。三免:蛋白原液:弗氏不完全佐劑=1:1，乳化4 h，注射方法同首免一樣。為了觀察免疫效果［7］，每次免疫前需耳耳緣靜脈采血1mL，免疫結(jié)束后第10d對其進行心臟采血30 mL，迅速帶回實驗室離心，將離心后的血清分裝于1.5 mL 離心管中，－20℃保存。

1.2.4 重組蛋白的抗血清瓊擴實驗及Fas的血清IgG的分離

制作濃度為1%的90 mm的瓊脂糖平板。用孔徑為2 mm 打孔器在瓊脂板上打7 個孔。將－20℃保存的血清溶化后倍比稀釋，稀釋倍數(shù)為原液、2、4、8、16、32 倍，將其依次加入圓周上的孔，在圓心中的孔內(nèi)加入重組蛋白原液，37℃培養(yǎng)24 h。

使用飽和硫酸銨法［10］提取純化抗重組蛋白Fas的IgG，然后倍比稀釋純化好的抗血清IgG，稀釋倍數(shù)為原液、2、4、8 倍，然后進行SDS－PAGE 電泳檢測。最后再根據(jù)Western blotting 對重組蛋白進行分析［11］。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白包涵體的純化

用電洗脫法純化重組蛋白pET－28a－ Fas 經(jīng)SDS－PAGE 電泳檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 重組蛋白包涵體pET－28a－Fas的純化

2.2 抗血清的抗原性分析

2.2.1 抗血清的免疫原性測定

用瓊脂糖擴散試驗能夠檢測抗血清免疫原性，當抗血清稀釋到16 倍時仍然可以看到沉淀線，所以抗血清滴度為1:16，結(jié)果見圖2。

圖2 兔抗pET－28a－Fas 倍比稀釋血清

2.2.2 兔抗融合蛋白pET－28a－Fas 血清IgG的提取

用飽和(NH4)2SO4法提取純化可得到的抗融合蛋白pET－28a－Fas 血清的IgG，對其進行SDSPAGE 分析，結(jié)果見圖3。從圖上我們可以看到兩條清晰的條帶，其分子量大小約為50KDa 和25KDa。

圖3 抗融合蛋白pET－28a－Fas IgG

2.2.3 重組蛋白pET－28a－Fas的Western blotting 分析

將SDS－PAGE 電泳后的純化表達蛋白，轉(zhuǎn)移至NC 膜上，以兔抗的陽性血清為一抗，以HRP 偶聯(lián)羊抗兔的IgG 為二抗，底物使用聯(lián)苯胺，進行蛋白質(zhì)印跡分析，重組質(zhì)粒陽性菌表達產(chǎn)物能夠與兔抗羊陽性血清發(fā)生反應，這一現(xiàn)象表明蛋白質(zhì)具有抗原性。結(jié)果見圖4。

圖4 表達蛋白pET－28a－Fas的Western blotting 鑒定

3 討論

本實驗將包含有卡拉庫爾羊Fas 基因的序列克隆到了原核表達載體pET－28a 中，使用IPTG 進行誘導使Fas 重組蛋白在表達宿主菌中成功表達，利用正交分解法設計平行試驗組對表達條件進行優(yōu)化，最終將融合蛋白表達量提高到了15.6%。其分子量大小為為39.7KDa。

實驗中的原核表達系統(tǒng)采用的表達方式是融合蛋白表達。這種表達方式可利用親和層析的方法來檢測和純化目的蛋白，其次防止目的蛋白被宿主細胞蛋白酶降解。

經(jīng)過可溶性分析發(fā)現(xiàn)本實驗中的Fas 主要以包涵體的形式存在。大量不溶性蛋白和RNA 凝聚會形成包涵體，它包含了大部分目的蛋白。包涵體的優(yōu)點在于其能夠保護目的蛋白不被水解，其次不用擔心破碎細胞過程中高溫導致的蛋白質(zhì)變性，再次能夠通過離心收集較純的目的蛋白［12］。同時包涵體也存在著一些問題，這主要體現(xiàn)在包涵體的不溶與無活性兩個方面，這都會給純化工作造成麻煩。

抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應答的能力被稱為抗原性，其強弱不僅與抗原分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，同時也與免疫動物親緣關(guān)系有關(guān)系?？乖钥煞譃槊庖咴院头磻裕磻灾缚乖芘c其刺激產(chǎn)生的致敏淋巴細胞或抗體發(fā)生反應［13］。

本試驗利用瓊擴實驗和蛋白質(zhì)印跡法證明了融合蛋白pET－28a－Fas 是一種完全抗原，具有較好的免疫原性和反應原性。

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