李延榮 陳 偉，2

(1 新疆兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

(2 新疆兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

奶牛乳腺炎是危害奶牛業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，流行病學(xué)調(diào)查表明使用抗生素治療其治愈率在0～80%之間不等，其中最難治療的是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的感染。而近年來(lái)的研究表明［1］，金黃色葡萄球菌形成的生物膜具有高度的耐藥性并能逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，其感染易慢性化并難于控制。因此研究奶牛乳腺炎的病原菌之一——金黃色葡萄球菌生物膜形成狀況及機(jī)制尤為重要。本研究檢測(cè)了分離自本地區(qū)奶牛場(chǎng)的金黃色葡萄球菌其生物膜形成狀況以及可能在生物膜形成的不同階段發(fā)揮作用的相關(guān)基因的分布情況，為該地區(qū)金黃色葡萄球菌感染引起的奶牛乳腺炎防制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀(Bio－Rad)、移液槍(Eppendorf)、恒溫培養(yǎng)箱(上海)、水浴鍋(金怡)、96孔板(Labphil Biotechnology)、電熱恒溫干燥箱(DHG－9031A)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB培養(yǎng)基，BactoTM)、PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自東盛生物公司，實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC35984(BF+)由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送，其它實(shí)驗(yàn)菌株均為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定所得。

1.4 金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的檢測(cè)

根據(jù)任曉鏷等［2］的方法，即將富集培養(yǎng)過(guò)夜的菌液按1:100比例吸取20 μL菌液接種至2 mL TSB液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻后，吸取200 μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株接種4孔，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(ATCC 35984)及空白對(duì)照(不加菌液的TSB培養(yǎng)基)各4孔。37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液輕輕拍出，無(wú)菌水洗去未粘附的懸浮菌體及培養(yǎng)液，該步驟重復(fù)4次。56℃烘干固定1 h。用50 μL 0.5%結(jié)晶紫染液浸染5 min，流水沖洗多余染液，直至沖洗流出的水為無(wú)色，37℃晾干。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的OD值。所有生物膜形成檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù)3次。

1.5 金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因檢測(cè)

1.5.1 ica 基因的檢測(cè)

［3］中icaA基因的引物序列合成引物，見(jiàn)表1

表1 ica依賴型生物膜形成相關(guān)基因

PCR反應(yīng)條件:

預(yù)變性95℃，5 min;變性 95℃，60 s;退火50℃，30 s;延伸72℃，30 s;36個(gè)循環(huán);末次循環(huán)后72℃，10 min;電泳檢測(cè)。

1.5.2 非ica基因的檢測(cè)

參考相關(guān)文獻(xiàn)［4，5］選擇7個(gè)與金黃色葡萄球菌生物膜形成有關(guān)的基因，并設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表2

PCR反應(yīng)條件:

預(yù)變性95℃，5 min;變性 95℃，60 s;退火45℃，30 s;延伸72℃，30 s;36個(gè)循環(huán);末次循環(huán)后72℃，10 min;電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌生物膜形成的表型檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用微量板半定量法對(duì)患有隱性乳房炎的奶牛乳樣中分離得到的金黃色葡萄球菌進(jìn)行生物膜形成的表型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，112株金黃色葡萄球菌中，有31株菌可形成不同強(qiáng)度的生物膜，約占檢測(cè)菌株總數(shù)的27%。說(shuō)明在當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)能形成生物膜的乳房炎金黃色葡萄球菌已經(jīng)占有了一定的比例，這種生物膜形成菌株的出現(xiàn)，為臨床治療奶牛乳房炎提出了新的要求。

2.2 ica基因座在實(shí)驗(yàn)菌株中的分布情況

本實(shí)驗(yàn)對(duì)112株金黃色葡萄球菌臨床分離株進(jìn)行icaA基因的PCR檢測(cè)，其中含有icaA基因的菌株15株，占檢測(cè)菌株總數(shù)的13.4%(15/112)。

2.3 ica非依賴性生物膜形成相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離獲得的112株金黃色葡萄球菌，分別進(jìn)行 sarA、ccp、luxS、sigB、agrC、bap、tcaR 7 個(gè)基因的PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，112株金黃色葡萄球菌分離株上述7種基因的分布存在較大差異，其生物膜形成能力也存在差別，具體結(jié)果見(jiàn)表3。其中34株擴(kuò)增出luxS基因的菌株和36株擴(kuò)增出sarA基因的菌株，各有6株能形成不同強(qiáng)度的生物膜，分別占基因擴(kuò)增陽(yáng)性菌株數(shù)的18%和17%，而其中生物膜形成能力較強(qiáng)的菌株5－100－1和5－128－2都含有ica及ccp基因，說(shuō)明菌株生物膜形成能力可能與ica及ccp基因的產(chǎn)物有關(guān)。

表3 非ica依賴型各個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 ica基因在細(xì)菌生物膜形成中的作用

細(xì)菌生物膜(biofilm formation，BF)的形成主要經(jīng)過(guò)四個(gè)階段:細(xì)菌的初始黏附，細(xì)菌的聚集，細(xì)菌生物膜的成熟和生物膜細(xì)菌的釋放。而根據(jù)其在初始粘附階段依賴的胞外多聚物是以多糖為主還是以其它物質(zhì)，如蛋白質(zhì)為主，可將細(xì)菌生物膜形成機(jī)制分為 ica依賴型和 ica非依賴型兩種［4，6］。ica基因座以操縱子的形式存在于細(xì)菌染色體上，主要包括icaA、icaD、icaB和icaC以及位于icaA上游的阻遏基因icaR［5］，icaADBC介導(dǎo)產(chǎn)生的胞外多糖是ica依賴性生物膜形成初始粘附階段的主要功能性物質(zhì)，而其中含有的II型多糖PIA(polysac charide－intercellular adhesin)是生物膜的主要組成成份，也是細(xì)胞成簇的主要功能性物質(zhì)［7］。本研究檢測(cè)的菌株中，含有icaA基因的有15株，生物膜檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物膜陽(yáng)性菌株中含有icaA基因的菌株僅有2株，即不是所有含ica基因的金葡菌都能形成生物膜，且有部分生物膜陽(yáng)性菌株并不含有ica基因。

對(duì)于ica基因座在菌株中的分布與生物膜陽(yáng)性菌株的相關(guān)性，劉慶中等研究表明，檢測(cè)含有ica基因座的菌株與生物膜表型檢測(cè)的陽(yáng)性菌株結(jié)果并不一致，即檢測(cè)含有ica基因座的菌株其生物膜表型檢測(cè)呈陰性［8］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是ica基因的表達(dá)受環(huán)境因素以及生物膜非ica依賴性機(jī)制導(dǎo)致的結(jié)果。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明該地區(qū)奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成存在ica依賴性及ica非依賴性兩種形成機(jī)制［4］，而任曉鏷等研究者檢測(cè)同一地區(qū)的表皮葡萄球菌中未檢測(cè)到ica基因［6］，說(shuō)明本地區(qū)表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌生物膜的形成機(jī)制存在差異。

3.2 群感效應(yīng)(quorum sensing，QS)相關(guān)基因在細(xì)菌生物膜形成中的作用

群感效應(yīng)是指細(xì)菌能夠分泌特定的信號(hào)分子并感應(yīng)它的濃度，當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到閾值時(shí)，可以調(diào)控生物膜形成和其它生物學(xué)功能，如毒力因子的分泌等。在葡萄球菌中與群感效應(yīng)有關(guān)的基因有agr、luxS、sarA、sigB 等基因。

群感效應(yīng)附屬基因調(diào)節(jié)子(accessory gene regulator，agr)系統(tǒng)是葡萄球菌生物膜形成的重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，即agr系統(tǒng)。agr系統(tǒng)組成成分之一AgrC具有組氨酸蛋白激酶活性，它與另一個(gè)組分AgrA共同構(gòu)成了金黃色葡萄球菌雙組成信號(hào)傳遞系統(tǒng)。agr系統(tǒng)激活后，能夠通過(guò)不同途徑調(diào)節(jié)一系列相關(guān)基因的表達(dá)［9，10］。本實(shí)驗(yàn)對(duì) agrC 基因進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明有3株菌含有agrC基因，而這3株菌恰恰為生物膜形成陰性菌株。有學(xué)者已經(jīng)在表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)agr系統(tǒng)可降低細(xì)菌對(duì)聚合物固相表面的粘附能力，負(fù)調(diào)控生物膜的形成［11，12］。本研究的結(jié)果可能支持了這一結(jié)論。

在表皮葡萄球菌中l(wèi)uxS主要通過(guò)調(diào)節(jié)ica基因座的轉(zhuǎn)錄及PIA的產(chǎn)生，達(dá)到抑制生物膜形成的作用。但在金黃色葡萄球菌中，該基因是否對(duì)金黃色葡萄球菌的生物膜形成有關(guān)尚不明確［9］。本實(shí)驗(yàn)室分離得到的金黃色葡萄球菌中該基因存在于其中的34株菌中，而只有6株生物膜陽(yáng)性菌株中含有該基因。Kuehl等研究表明抑制金黃色葡萄球菌luxS的表達(dá)，可促進(jìn)生物膜的形成，說(shuō)明luxS對(duì)生物膜形成能力起負(fù)調(diào)控作用。而本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明82%含有該基因的菌株不能形成生物膜，也驗(yàn)證了這一結(jié)論。

sarA基因是葡萄球菌附屬調(diào)節(jié)因子A(staphylococcal accessory regulator A，sarA)，是另一個(gè)群感效應(yīng)系統(tǒng)的成員，編碼SarA蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌中sarA基因?qū)IA的合成是必須的。在金黃色葡萄球菌中，sarA還可以正調(diào)控生物膜形成相關(guān)蛋白Bap的表達(dá)，表明該基因參與葡萄球菌生物膜形成的ica依賴性與ica非依賴性兩條途徑［4］。本實(shí)驗(yàn)在112株檢測(cè)菌株中，含有sarA基因的菌株36株，而在生物膜陽(yáng)性菌株中檢測(cè)到含有該基因的菌株有6株，同時(shí)還含有ica基因的有2株。這一結(jié)果說(shuō)明本地區(qū)分離獲得的奶牛乳房炎性金黃色葡萄球菌其sarA基因可能參與了生物膜形成的ica依賴性與ica非依賴性兩條途徑。

sigB基因是調(diào)控葡萄球菌生物膜形成及毒素因子表達(dá)的全局調(diào)節(jié)子，因此其功能比較復(fù)雜。在金黃色葡萄球菌中該基因可對(duì)agr及sar基因進(jìn)行調(diào)控，從而影響生物膜的形成。本實(shí)驗(yàn)分離得到的臨床分離株中，含有該基因的菌株38株，生物膜陽(yáng)性菌株為4株，其中2株菌同時(shí)含有sarA基因及sigB基因。但sigB基因在這些菌中的作用需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 其它基因在葡萄球菌生物膜形成中的作用

bap基因，即生物膜相關(guān)蛋白基因(biofilm－associated protein，bap)編碼金黃色葡萄球菌表面蛋白Bap。Bap蛋白在BF形成的不同階段，其表達(dá)量呈周期性變化，以促進(jìn)黏附或促進(jìn)釋放。本實(shí)驗(yàn)室分離得到的金黃色葡萄球菌含有bap基因的菌株17株，而其中僅有1株為生物膜陽(yáng)性菌株，同時(shí)該菌株含有sarA基因，說(shuō)明bap基因表達(dá)可能受sarA基因的正調(diào)控［4，9］。

ccp基因主要是在葡萄球菌生物膜形成的聚集及細(xì)胞成叢階段發(fā)揮作用，敲除該基因則不能形成成熟的生物膜，但不影響生物膜形成過(guò)程中的初始粘附階段。本實(shí)驗(yàn)分離得到含ccp基因金黃色葡萄球菌51株，31株生物膜陽(yáng)性菌株中有7株菌含有該基因。生物膜形成能力較強(qiáng)的2株菌同時(shí)含有ica及ccp基因，而另有2株生物膜形成弱陽(yáng)性菌株只含有ccp基因而不含ica基因。說(shuō)明ccp基因與ica基因的表達(dá)產(chǎn)物可能相互協(xié)同，共同促進(jìn)生物膜的形成。

tcaR基因在一般情況下，會(huì)與特定的DNA序列相互作用以抑制生物膜形成，當(dāng)抗生素，如替考拉寧存在時(shí)，能與tcaR結(jié)合使tcaR的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而失去活性，使生物膜形成及抗藥性基因正常啟動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)室分離得到的12株金黃色葡萄球菌含有該基因，其中11株為生物膜形成陰性菌株，可能與tcaR基因?qū)ι锬さ呢?fù)調(diào)控有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)當(dāng)?shù)啬膛Ｈ橄傺仔越瘘S色葡萄球菌生物膜形成表型和相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，當(dāng)?shù)胤蛛x獲得的金黃色葡萄球菌其生物膜形成同時(shí)存在ica依賴性與ica非依賴性兩條途徑，且所選擇的8個(gè)與生物膜形成有關(guān)的基因在本地區(qū)奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成菌株中均有不同比例的分布。該研究結(jié)果說(shuō)明本地區(qū)奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成機(jī)制復(fù)雜，為防制葡萄球菌生物膜引起的相關(guān)感染奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］李方去，楊錦紅，王慧燕，等.兩種臨床標(biāo)本中耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的檢測(cè)與其耐藥特征的研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24(6):531－534.

［2］任曉鏷，陳偉，張利莉.不同理化因素對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成的影響［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20(12):1－5.

［3］Ciftci A，F(xiàn)indik A，Onuk E E，et al.Detection of methicillin－resistanceandslimefactorproductionof Staphylococcus aureus in bovine mastitis［J］.Braz J Microbiol，2009，40(2):254 － 261.

［4］陳偉.奶牛乳房炎葡萄球菌生物被膜形成機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31(12):996 －1000.

［5］孫鳳軍，枉前，夏培元.臨床分離金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因的 PCR分析［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(15):1447 －1449.

［6］任曉鏷，陳偉，張利莉.新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜形成及其相關(guān)基因的檢測(cè)［J］.塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，23(3):14 －18.

［7］Melchior M B，Vaarkamp H，F(xiàn)ink － Gremmels J.Biofilms:a role in recurrent mastitis infections［J］.Vet J，2006，171(3):398 －407.

［8］劉慶中，韓立中，孫景勇，等.高水平莫匹羅星耐藥MRSA體外生物膜形成能力及相關(guān)基因檢測(cè)［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2011，11(4):276 －280.

［9］周學(xué)東，施文元.微生物生物膜與感染［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012.

［10］張東偉，溫紅俠，陳一強(qiáng).金黃色葡萄球菌生物被膜形成調(diào)控機(jī)制與治療策略進(jìn)展［J］.國(guó)際呼吸雜志，2009，29(20):1273 －1276.

［11］Vuong C，Saenz H L，Gotz F，et al.Impact of the agr quorum－sensing system on adherence to polystyrene in Staphylococcus aureus［J］.J Infect Dis，2000，182(6):1688－1693.

［12］Vuong C，Kocianova S，Yao Y，et al.Increased colonization of indwelling medical devices by quorum－sensing mutants of Staphylococcus epidermidis in vivo［J］.J Infect Dis，2004，190(8):1498 －1505.