余少鴻，湯榮春，Per H Basse

（1.云南省昆明市第一人民醫(yī)院普外科 650011；2.美國(guó)匹茲堡大學(xué)腫瘤中心，匹茲堡PA 15213－1863）

細(xì)胞免疫在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用，其中自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）及細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL細(xì)胞）是體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞[1]。有研究表明，組織相容性抗原Ⅰ類（MHCⅠ）限制性導(dǎo)致CTL細(xì)胞不能有效殺滅腫瘤細(xì)胞。下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面人類白細(xì)胞抗原（HLA）是腫瘤細(xì)胞逃逸CTL細(xì)胞重要原因之一[2]。MHCⅠ類抗原部分或全部缺失是黑色素瘤對(duì)CTL細(xì)胞不敏感因素之一[3－4]。NK細(xì)胞可直接殺傷血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織[5]，并且對(duì)黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞也有殺滅作用[6－8]。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2（IL－2）、IL－12和IL－18可增強(qiáng)其殺傷及分泌功能[9]。因此，現(xiàn)將本研究NK細(xì)胞上清液提高CTL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力及機(jī)制報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與腫瘤細(xì)胞 選擇匹茲堡大學(xué)腫瘤中心Jackson實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌環(huán)境飼養(yǎng)的C57BL／6雌性裸鼠，8～12周齡，體質(zhì)量20～30 g；M05黑色素瘤細(xì)胞由Per H Basse實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)，于RPMI1640液中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 NK及CTL細(xì)胞表型檢測(cè) 從C57BL／6裸鼠提取出脾臟，磨碎，使之成單細(xì)胞懸液；1 200 r／min，離心5 min；溶解紅細(xì)胞3 min，再離心，過(guò)濾，制成脾細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，T75培養(yǎng)瓶中加入25 mL培養(yǎng)液及6 000 IU／mL IL－2培養(yǎng)。2 d后，用抗CD3抗體磁珠（Dynal Biotech，Lake Success，NY，USA）法純化，敲除T細(xì)胞，制成NK細(xì)胞，再加入6 000 IU／mL IL－2培養(yǎng)2～3 d后，制得活化的NK細(xì)胞。收獲細(xì)胞，把每管0.5×107／mL細(xì)胞離心，取沉淀，混勻，添加抗體NK 1.1＋、NKp 46、CD3＋、CD4＋和CD8＋各2μL，流式細(xì)胞儀（fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）檢測(cè)表型。NK細(xì)胞表型：NKp46＞90%，NK1.1＋＞90%，CD8＋＜2%，CD4＋＜2%。同上提取脾細(xì)胞，加入8μg／mL PHA和600 IU／mL IL－2培養(yǎng)。2 d后，可見(jiàn)大量細(xì)胞聚集成團(tuán)，靜置5～7 min，輕輕拋棄上清液，即可獲得細(xì)胞團(tuán)塊，再加入600 IU／mL IL－2培養(yǎng)2 d后，即可制得CTL細(xì)胞。CTL細(xì)胞表型：CD8＋＞90%，CD3＋＞90%，NK1.1＋＜5%，CD4＋＜2%。NK細(xì)胞在IL－2，IL－2＋I(xiàn)L－12，IL－2＋I(xiàn)L－18或IL－2＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18條件下培養(yǎng)，提取上清液。同上法準(zhǔn)備NK細(xì)胞，用抗CD3磁珠法純化，再加入6 000 IU／mL IL－2培養(yǎng)1 d后，加入IL－12（10 ng／mL）和IL－18（100 ng／mL）或同時(shí)加入IL－12（10 ng／mL）及IL－18（100 ng／mL），再培養(yǎng)48 h后，2 000 r／min離心10 min，收集上清液，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA法檢測(cè)上清液的IFNγ含量 將各種細(xì)胞因子活化的NK細(xì)胞上清液分為4組，分別為NK上清液，NK＋I(xiàn)L－12上清液，NK＋I(xiàn)L－18上清液，NK＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18上清液，按照說(shuō)明書應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IFNγ，重復(fù)3次。

1.4 檢測(cè)M05細(xì)胞表面MHCⅠ（H－2Kb）表達(dá) 收集M05細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107／mL，與NK細(xì)胞在IL－2，IL－2＋I(xiàn)L－12，IL－2＋I(xiàn)L－18，IL－2＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18條件下提取的上清液125μL孵育過(guò)夜。1 d后，收獲所有腫瘤細(xì)胞，加入H－2Kb抗體染色30 min，PBS緩沖液洗滌2次后，0.25%多聚甲醛固定，F(xiàn)ACS計(jì)數(shù)5 000細(xì)胞，檢查MHCⅠ表達(dá)。

1.5 檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)CTL細(xì)胞的殺傷率 將51Cr溶液與靶細(xì)胞[與不同NK上清液及干擾素γ（IFNγ）]10 ng／mL培養(yǎng)過(guò)夜M05細(xì)胞，高表達(dá)MHCⅠ類分子；或預(yù)先用6μg／mL IFNγ抗體與1∶8 NK細(xì)胞上清液及IFNγ10 ng／mL各1 mL孵育30 min后，再與NK上清液培養(yǎng)過(guò)夜的M05細(xì)胞）混合，實(shí)驗(yàn)共分為6組，分別為M05組（陰性對(duì)照組），M05＋I(xiàn)FNγ組（陽(yáng)性對(duì)照組），M05＋NK上清液組，M05＋NK＋I(xiàn)L－12上清液組，M05＋NK＋I(xiàn)L－18上清液組，M05＋NK＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18上清液組，于37℃培養(yǎng)1 h左右，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。收集CTL細(xì)胞，將待檢細(xì)胞毒性的細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞混合4 h（比例約為200∶1），用γ射線測(cè)量?jī)x檢測(cè)上清液中的51Cr放射脈沖數(shù)（cpm）值，即可計(jì)算出待檢細(xì)胞殺傷活性的高低。

特異性腫瘤細(xì)胞殺傷率（%）＝（特異性釋放－自發(fā)性釋放）／（最大量釋放－自發(fā)性釋放）×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，IFNγ抗體封閉后采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NK細(xì)胞上清液對(duì)M05細(xì)胞表面MHCⅠ表達(dá)的結(jié)果 IL－2能夠激活NK細(xì)胞增殖，結(jié)合其他細(xì)胞因子如IL－12及IL－18，能大量刺激NK細(xì)胞增殖，釋放大量細(xì)胞因子，從IL－2、IL－2＋I(xiàn)L－12、IL－2＋I(xiàn)L－18、IL－2＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18條件下活化的NK細(xì)胞提取的上清液，即使稀釋濃度為1∶8，也能有效提高M(jìn)05細(xì)胞表面MHCⅠ表達(dá)。加入6μg／mL IFNγ抗體與NK上清液125μL孵育30 min，再與腫瘤細(xì)胞孵育過(guò)夜后，升高的MHCⅠ降至正常。見(jiàn)表1。

表1 M05細(xì)胞與1∶8 NK上清液＋／－IFNγ抗體MHC平均熒光強(qiáng)度的表達(dá)

2.2 IL－2、IL－2＋I(xiàn)L－12、IL－2＋I(xiàn)L－18、IL－2＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18活化NK細(xì)胞分泌的IFNγ含量 NK＋I(xiàn)L－12上清液、NK＋I(xiàn)L－18上清液、NK＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18上清液的IFNγ高于NK上清液的IFNγ含量（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 NK上清液、NK＋I(xiàn)L－12上清液、NK＋I(xiàn)L－18上清液、NK＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18上清液的IFNγ含量

2.3 CTL細(xì)胞對(duì)黑色素瘤靶細(xì)胞的殺傷活性 M05黑色素瘤細(xì)胞高表達(dá)OVA抗原及低表達(dá)MHCⅠ類分子，與NK上清液孵育過(guò)夜后能提高M(jìn)05細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)，CTL細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.4 CTL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞4 h的殺傷率 1∶8 NK細(xì)胞上清液與CTL細(xì)胞孵育過(guò)夜后，可見(jiàn)與NK細(xì)胞上清液孵育的CTL細(xì)胞并不能提高CTL細(xì)胞對(duì)M05細(xì)胞殺傷率，見(jiàn)圖2。

圖1 CTL對(duì)靶細(xì)胞4 h細(xì)胞毒性（n＝3）

圖2 CTL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞4 h的殺傷率（n＝3）

3 討 論

本研究證實(shí)，體內(nèi)外活化NK細(xì)胞需要IL－2維持，其他細(xì)胞因子，如IL－12及IL－18能增強(qiáng)其作用，IL－2是激發(fā)細(xì)胞因子如TNFα及IFNγ級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因素。作者資料顯示IL－2、IL－2＋I(xiàn)L－12、IL－2＋I(xiàn)L－18、IL－2＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18條 件下培養(yǎng)NK細(xì)胞在形態(tài)及功能上具有明顯差異，并且IL－2＋I(xiàn)L－12、IL－2＋I(xiàn)L－18、IL－2＋I(xiàn)L－12＋I(xiàn)L－18培養(yǎng)NK細(xì)胞分泌的IFNγ比僅用IL－2培養(yǎng)NK細(xì)胞更高，并 且，IL－12，IL－18需 要 與IL－2共同刺激才能使NK細(xì)胞活化并分泌大量IFNγ[12]。研究證實(shí)，不同細(xì)胞因子刺激的NK細(xì)胞上清液均能提高M(jìn)05細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)，并且只需要1∶8上清液即可顯著提高M(jìn)05細(xì)胞MHCⅠ表達(dá)，其作用機(jī)理與NK細(xì)胞上清液中的IFNγ含量有關(guān)，抑制IFN的表達(dá)即可降低腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ分子。

CTL細(xì)胞在體內(nèi)能直接破壞黑色素瘤細(xì)胞，因此，CTL細(xì)胞已經(jīng)成為腫瘤免疫的熱點(diǎn)之一[13]。本研究結(jié)果顯示，正常M05細(xì)胞低表達(dá)MHCⅠ類分子而高表達(dá)OVA抗原，因此，CTL細(xì)胞對(duì)其殺傷率低，但M05細(xì)胞與NK上清液培養(yǎng)后，提高黑色素瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)，從而提高CTL細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的殺傷性，這種殺傷作用通過(guò)提高黑色素瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)而發(fā)揮間接作用，為進(jìn)一步研究聯(lián)合應(yīng)用NK及CTL細(xì)胞協(xié)調(diào)殺傷腫瘤細(xì)胞提供良好的理論基礎(chǔ)。

[1]Goding S，Yang Q，Mi Z，et al.Targeting of products ofgenes to tumor sites using adoptively transferred A－NK and T－LAK cells[J].Cancer Gene Ther，2007，14（5）：441－450.

[2]Aptsiauri N，Cabrera T，Mendez R，et al.Role of altered expression of HLA class I molecules in cancer progression[J].Adv Exp Med Biol，2007，601：123－131.

[3]Mendez R，Rodriguez T，Del CA，et al.Characterization of HLA class I altered phenotypes in a panel of human melanoma cell lines[J].Cancer Immunol Immunother，2008，57（5）：719－729.

[4]Rodriguez T，Méndez R，Roberts CH，et al.High frequency of homozygosity of the HLA region in melanoma cell lines reveals a pattern compatible with extensive loss of heterozygosity[J].Cancer Immunol Immunother，2005，54（2）：141－148.

[5]Basse P，Goldfarb RH.Localization of immune effector cells to tumor metastases[J].Immunol Ser，1994，61：149－158.

[6]Basse P，Goldfarb RH，Herberman RB，et al.Accumulation of adoptively transferred A－NK cells in murine metastases：kinetics and role of interleukin－2[J].In Vivo，1994，8（1）：17－24.

[7]Yang Q，Hokland ME，Bryant JL，et al.Tumor－localization by adoptively transferred，interleukin－2－activated NK cells leads to destruction of well－established lung metastases[J].Int J Cancer，2003，105（4）：512－519.

[8]Kjaergaard J，Hokland M，Nannmark U，et al.Infiltration patterns of short－and long－term cultured A－NK and TLAK cells following adoptive immunotherapy[J].Scand J Immunol，1998，47（6）：532－540.

[9]Lauwerys BR，Garot N，Renauld JC，et al.Cytokine production and killer activity of NK／T－cells derived with IL－2，IL－15，or the combination of IL－12 and IL－18[J].J Immunol，2000，165（4）：1847－1853.

[10]Tsai L，Ljunggren HG，Hansson M，et al.Effect of IFNgamma treatment and in vivo passage of murine tumor cell lines on their sensitivity to lymphokine－activated killer（LAK）cell lysis in vitro；association with H－2 expression on the target cells[J].Int J Cancer，1989，44（4）：669－674.

[11]Timothy NJ，Bullock，David W，et al.Manipulation of avidity to improve effectiveness of adoptively transferred CD8（＋）T cells for melanoma immunotherapy in human MHC class I－transgenic mice[J].Immunology，2001，167（10）：5824－5831.

[12]余少鴻，湯榮春，溫小明.不同細(xì)胞因子活化的NK細(xì)胞形態(tài)及功能的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（21）：2099－2101.

[13]余少鴻，湯榮春，Per H Basse.聯(lián)合應(yīng)用NK細(xì)胞及CTL對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012；41（9）：878－880.