易正金，陳 剛，張 堯，Shiv Kumar Yadav，何云鋒△

（1.攀枝花鋼鐵公司職工總醫(yī)院泌尿外科，四川攀枝花617023；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué) 400016）

膀胱癌是中國泌尿外科最常見的惡性腫瘤，膀胱癌的治療包括可見腫瘤的切除以及后續(xù)的膀胱灌注化療。但在經(jīng)綜合治療的患者中，45%的患者會再發(fā)，再發(fā)患者中20%～30%的患者腫瘤會發(fā)展成為浸潤性膀胱癌[1]。而且，部分患者因不能夠耐受化療藥物的不良反應(yīng)而不能完成膀胱灌注化療。因此尋找一種安全、有效的，且能有效降低化療藥物不良反應(yīng)的藥物載體成為泌尿外科工作者亟待解決的課題。

1 材料與方法

1.1 材料 修飾的單壁納米碳管（SWNT）－吡柔比星（THP）復(fù)合物的制備：將SWNT和0.2 mmol／L的磷酸支鏈乙二醇混合，在超聲碎化的條件下反應(yīng)30 min，然后反復(fù)過濾、沖洗、制備出活化的SWNT。在超聲碎化的條件下根據(jù)說明書將琥珀酰酐和THP反應(yīng)，使琥珀酰酐中的羧酸基團(tuán)結(jié)合在THP上；將修飾的SWNT在8 mmol／L N－羥基丁二酰亞胺和8 mmol／L 1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽條件下在搖床上反應(yīng)6 h。用p H為7.4的PBS將ACNP－THP混合溶液同比例稀釋。多余的沒有反應(yīng)的THP分子通過濾器和反復(fù)PBS沖洗清除掉。SWNT的長度在100～150 nm之間。SWNT的載藥量為每毫升SWNT含THP 10 mg。

1.2 SWNT－THP對人膀胱癌BIU－87細(xì)胞抑制作用研究 BIU－87細(xì)胞（購自上海細(xì)胞庫）在含10%胎牛血清（Hyclone公司）的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)（Hyclone公司）。胰蛋白酶消化后將細(xì)胞制懸，接種在6孔板中，分別加入SWNT、THP和SWNT－THP復(fù)合物共培養(yǎng)8 h。CSFE增值試劑盒（白云山公司）用于檢測細(xì)胞活性。CSFE加入細(xì)胞懸液在黑暗中反應(yīng)10 min，然后通過加入等體積的含血清細(xì)胞培養(yǎng)液終止染色，同時用無菌水沖洗。熒光強(qiáng)度通過倒置顯微鏡以及流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 大鼠原位膀胱癌模型的建立 60只8周齡的SD大鼠用N－甲基－N－亞硝基脲（MNU）行膀胱灌注，每次每只大鼠注射0.2 mg，每兩周1次，一共4次。第9周末取大鼠膀胱行病理學(xué)檢查。建模成功的42只大鼠被隨機(jī)分成4組（SWNT組6只，THP組15只，SWNT－THP復(fù)合物組15只，生理鹽水組6只），分別用SWNT、THP、SWNT－THP復(fù)合物以及生理鹽水行膀胱灌注治療。THP的用量標(biāo)化到5 mg／kg。

1.4 THP釋放檢測 灌注治療后0、1、2、4 h，通過膀胱穿刺取大鼠尿液，用分光光度計研究大鼠尿液THP濃度。標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線用萬樂公司提供的THP標(biāo)準(zhǔn)品建立。

1.5 體內(nèi)腫瘤抑制作用檢測 灌注化療后2 d，從每組中隨機(jī)選取2只大鼠，取大鼠膀胱腫瘤組織。將腫瘤組織通過剪碎、研磨制備成腫瘤細(xì)胞懸液。腫瘤細(xì)胞通過PI染色行流式細(xì)胞檢查凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以±s表示，組間比較采用ANOVA或者t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3種材料對BIU－87細(xì)胞抑制作用 SWNT對BIU－87細(xì)胞無明顯抑制效應(yīng)；THP和SWNT－THP可明顯抑制BIU－87細(xì)胞增殖，其中SWNT－THP作用更明顯。SWNT、THP和SWNT－THP對BIU－87細(xì)胞的抑制率分別為（1.74±0.56）%、（51.24±1.45）%和（74.35±2.56）%。

圖1 3種材料對BIU－87細(xì)胞抑制作用

2.2 各種材料對體內(nèi)腫瘤的抑制作用 SWNT、THP和SWNT－THP體內(nèi)腫瘤抑制率率分別為（7.42±1.85）%，（52.46±2.41）%和（96.85±0.85）%。組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 THP緩釋效應(yīng)研究結(jié)果 SWNT－THP和THP灌注后，大鼠尿液中THP濃度變化曲線見圖2。在灌注1 h后THP灌注大鼠尿液中幾乎不能夠檢測到THP。

圖2 THP在尿液中釋放曲線圖

2.4 不良反應(yīng)觀察結(jié)果 在THP灌注的15只大鼠中，12只出現(xiàn)尿頻，7只出現(xiàn)血尿。在SWNT－THP灌注大鼠中沒有出現(xiàn)尿頻或者血尿。兩組大鼠在實(shí)驗前后肝、腎功能檢查未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。

3 討 論

THP是中國泌尿外科常用的一種膀胱內(nèi)化療藥物，但是由于其溶解度較低，部分患者不能夠耐受其不良反應(yīng)，因此其在臨床的應(yīng)用受到極大的限制。如何提高其治療作用以及降低其不良反應(yīng)成為亟待解決的難題。國外一項針對絲裂霉素C的三期臨床研究認(rèn)為提高藥物的靶向輸送可有效提高其對表淺性膀胱腫瘤的治療效果[2]。因此，新型的針對膀胱灌注化療的藥物載體的研究為解決該問題提供了一個思路。

SWNT由于其超大的比表面積以及在組織滲透性和組織存留方面的特點(diǎn)成為一種新型的腫瘤靶向的藥物載體[3－4]。目前的研究認(rèn)為納米活性炭可將大量的生物活性分子，包括藥物、多肽、DNA等輸送至細(xì)胞內(nèi)[5－8]；其進(jìn)入細(xì)胞的方式包括胞吞以及自由擴(kuò)散[9]；血液中的單壁納米碳管可通過膽道系統(tǒng)自糞便中排泄出體外[10]；同時研究還認(rèn)為長期的納米暴露對機(jī)體不會造成傷害[11]。因此，本研究選擇SWNT－THP復(fù)合物膀胱灌注，同時觀察其對BIU－87細(xì)胞的抑制效應(yīng)及對大鼠原位膀胱癌的治療效果及不良反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，SWNT－THP復(fù)合物能夠有效抑制BIU－87細(xì)胞增殖；同時在體內(nèi)能有效地引起膀胱癌組織壞死，而不會引起正常組織的壞死；且無明顯不良反應(yīng)。SWNT－THP復(fù)合物能夠有效抑制BIU－87細(xì)胞增殖的原因在于：SWNT有效地提高了THP的溶解度。在本研究中作者將SWNT與磷酸支鏈乙二醇反應(yīng)，運(yùn)用化學(xué)加成的方法將磷酸支鏈（PEG）結(jié)合在單壁納米碳管上，其次運(yùn)用琥珀酰酐將一個羧基連接在THP分子上，將活化的THP分子與SWNT－PEG作用。通過一個可斷裂的鍵將吡柔比星以及單壁納米碳管結(jié)合在一起。因此，可有效地增強(qiáng)吡柔比星的水溶性。使藥物能夠達(dá)到對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的濃度。

除水溶性增強(qiáng)外，SWNT能夠特異性殺傷對腫瘤組織，可能與SWNT的緩釋性及能夠穿過腫瘤組織破壞血管有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)在血液中，以SWNT為載體的藥物承載系統(tǒng)能夠緩慢的釋放藥物[12－14]。本研究也發(fā)現(xiàn)負(fù)載在SWNT上面的THP能夠緩慢的釋放。甚至在大鼠首次排尿4 h后，還能夠檢測到THP分子；而單純用THP灌胃，在大鼠第1次排尿后幾乎不能夠檢測到THP在膀胱內(nèi)存在。SWNT－THP復(fù)合物的緩釋性保證了THP與腫瘤細(xì)胞的充分接觸，因此，可增強(qiáng)THP的腫瘤組織殺作用。SWNT可以使得淋巴細(xì)胞在腫瘤組織聚集，且能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞功能，而SWNT可被內(nèi)皮細(xì)胞吞噬系統(tǒng)吸收。因此，腫瘤組織對SWNT的吸收增強(qiáng)，同時由于腫瘤組織內(nèi)存在大量的生物活性物質(zhì)，使非共價結(jié)合的SWNT－THP復(fù)合物在與腫瘤接觸后能夠迅速水解，從而特異性殺傷腫瘤組織。

THP用于膀胱灌注主要的不良反應(yīng)有尿痛，尿頻，尿急，血尿和腎臟毒性等[15]。在本研究中，SWNT－THP復(fù)合物灌注大鼠沒有出現(xiàn)尿痛、尿頻、尿急、血尿和肝、腎臟毒性等不良反應(yīng)。

總之，SWNT顯示了較好的膀胱內(nèi)灌注化療的應(yīng)用前景，擁有PEG尾的單壁納米碳管能夠有效改善化療藥物的水溶性；其次，SWNT能夠增強(qiáng)腫瘤組織對于化療藥物的吸收，這種吸收具有一定的特異性；再次，SWNT對于組織基本沒有毒性。本研究報道了SWNT再膀胱內(nèi)灌注化療中的應(yīng)用，這將為膀胱癌的治療提供一種新的生物材料選擇，促進(jìn)膀胱腫瘤的治療研究。

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