顏曉勇，張茂平，吳蔚樺

（1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州遵義563003；2.瀘州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，四川瀘州646000）

糖尿病腎病（diabetes nephropathy，DN）為糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是導致終末期腎功能衰竭和糖尿病致死的主要原因。自噬（autophagy）是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細胞特有的生命現(xiàn)象，自噬性細胞死亡有別于凋亡（Ⅰ型程序性死亡），而被稱為Ⅱ型程序性死亡。近年來的研究提示，細胞自噬在腎臟疾病中扮演重要的角色，特別是足細胞病[1－2]，如微小病變腎病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）、膜性腎病、DN等，推測細胞自噬與DN的發(fā)生、發(fā)展有關，然而這方面的研究還鮮見報道。本研究檢測了DN大鼠模型各時間點細胞自噬標志蛋白——微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule－associated protein 1 light chain 3，LC3）的表達水平和細胞凋亡水平，探討其關系和意義，為進一步研究DN發(fā)病機制和干預治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 成年雄性SD大鼠48只，8周齡，體質(zhì)量（230±20）g，購至四川大學實驗動物中心。標準化飼養(yǎng)房籠子喂養(yǎng)。設模型組和正常對照組，每組設2、4、6和8周，共4個觀察時間點，各組每個時間點6只大鼠。模型組采用1%鏈脲菌素（STZ，Sigma公司）55 mg／kg一次性腹腔內(nèi)注射誘導造模。72 h后至少連續(xù)3 d尾靜脈采血測血糖，以連續(xù)3次血糖大于16.7 mmol／L，尿量大于原尿量的150%，尿蛋白排泄大于30 mg／24 h者為成模標準[3]。正常對照組用同劑量的生理鹽水腹腔注射。各實驗組均采用相同的大鼠標準食物和飲用水，成模后均未使用降糖藥。每周測定1次血糖、尿蛋白，并定期監(jiān)測一般項目。

表1 兩組大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比較（n＝6）

1.2 標本收集與生化指標檢測 在實驗的2、4、6、8周分別通過尾靜脈測量大鼠血糖，并將每只大鼠放入代謝籠留取24 h尿液，記錄24 h尿量，檢測24 h尿白蛋白量（ualb）和24 h尿肌酐濃度（ucrea）；同時從兩組中隨機選取6只大鼠處死，測量大鼠體質(zhì)量；股靜脈取血5 mL檢測血清肌酐（Cr）。經(jīng)腹主動脈灌注生理鹽水后摘取腎臟，立即將右腎組織存入―80℃低溫冰箱；稱取左腎質(zhì)量，取左腎組織10%甲醛固定，待作病理學檢查。計算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）和腎臟肥大指數(shù)（KI），公式為：Ccr＝[尿肌酐（mmol／L）×尿量（mL）×100]／[血肌酐（mmol／L）×體質(zhì)量（g）×1 440]，KI＝腎質(zhì)量／體質(zhì)量。

1.3 腎臟病理學檢測 普通HE染色，觀察兩組各時點腎小球、腎小管間質(zhì)病變。

1.4 腎臟LC3免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2甲醇液浸泡，微波修復抗原，正常羊血清封閉，先后滴加稀釋的一抗（兔抗大鼠LC3抗體，英國Abcam公司），羊抗兔二抗，ABC復合物及DAB顯色劑，蘇木素復染，脫水，透明，甘油明膠封片。以PBS代替一抗作為對照。先低倍鏡下觀察著染情況，再在高倍鏡下隨機選皮質(zhì)區(qū)30個腎小球，采用全自動圖像分析系統(tǒng)（Image－proplus 6.0）分別計數(shù)其積分光密度（IOD）值，取其均值分析。

1.5 原位末端標記法（TUNEL）染色觀察凋亡細胞 石蠟切片5μm，二甲苯脫蠟，PBS沖洗，胃蛋白酶消化，PBS沖洗；加TUNEL反應液（武漢博士德公司提供）37℃孵育60 min，PBS沖洗；加堿性磷酸酶抗體37℃孵育30 min，PBS沖洗；加1～2滴BCIP／NBT，室溫下孵育10～30 min，PBS沖洗；蘇木素復染；水性封片劑封片、烘干，光鏡觀察細胞核紅色為陽性。在光鏡下（×400），每組取6個樣本，每個樣本計數(shù)5個不同視野凋亡的腎小管細胞數(shù)，與同視野腎小管細胞總數(shù)的百分比率，計算其均值，以確定平均凋亡指數(shù)[4]。

1.6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，方差不齊時行數(shù)據(jù)對數(shù)變換使其方差齊，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK－q檢驗；兩組均數(shù)比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗；變量間的關系判斷采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠腎臟病理學比較 腎臟病理HE染色顯示正常對照組腎小球、腎小管間質(zhì)、腎臟血管未發(fā)現(xiàn)明顯異常，而模型組2周即出現(xiàn)明顯腎小球增大，系膜基質(zhì)逐漸增多，系膜細胞增多，小管擴張。

2.2 兩組大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比較 兩組大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比較見表1。

2.3 兩組大鼠LC3免疫組化結(jié)果比較 LC3主要表達于腎小管，模型組2、4、6、8周腎臟LC3陽性產(chǎn)物（棕黃色）IOD值均弱于對照組（P＜0.05）；模型組各時點間LC3陽性產(chǎn)物IOD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 LC3在大鼠腎組織中的表達情況（免疫組化染色）

2.4 兩組大鼠細胞凋亡指數(shù)比較 模型組2、4、6、8周腎臟凋亡細胞增多（紅色為凋亡細胞），主要出現(xiàn)于腎小管，其凋亡指數(shù)均高于對照組（P＜0.05）；模型組各時點凋亡指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

A：對照組；B、C、D、E：模型組2、4、6、8周。

2.5 相關性分析 模型組LC3表達量與尿蛋白、KI呈負相關（r＝―0.604，P＜0.01；r＝―0.653，P＜0.01）；模型組腎臟細胞凋亡指數(shù)與尿蛋白、KI呈正相關（r＝0.829，P＜0.01；r＝0.801，P＜0.01）；LC3表達量與細胞凋亡指數(shù)呈負相關（r＝―0.835，P＜0.01）。

3 討 論

DN的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，近年來的研究提示，自噬在腎臟疾病中扮演重要的角色，推測細胞自噬可能與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展有關。本研究顯示：LC3主要表達于腎小管，模型組2、4、6、8周腎臟LC3陽性產(chǎn)物（棕黃色）IOD值均弱于對照組（P＜0.05）；模型組各時點間LC3陽性產(chǎn)物IOD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組LC3的表達量與尿蛋白、KI呈負相關（P＜0.01）。提示自噬的缺乏可能促進了早期DN的發(fā)展。自噬在細胞和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用：（1）基礎性的自噬有修復細胞和維持細胞生命的作用；（2）過量的自噬會導致細胞程序性死亡[5]。細胞自噬水平的降低使其對腎臟細胞的修復和生命維持功能減弱，引起腎小管功能障礙，對蛋白的重吸收減少和適應細胞代謝負荷增加的功能亦減弱，從而可能導致腎臟損傷。

糖尿病時，內(nèi)皮細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運子表達增加而使胞內(nèi)葡萄糖含量增加[6]，進而增加了細胞內(nèi)活性氧，這可能是糖尿病腎病凋亡增加的主要機制[7]。這與本研究結(jié)果相一致，模型組2、4、6、8周腎臟凋亡細胞增多（紅色為凋亡細胞），主要出現(xiàn)于腎小管，其凋亡指數(shù)均高于對照組（P＜0.05）；模型組各時點凋亡指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組腎小管細胞凋亡指數(shù)與尿蛋白、KI呈正相關（P＜0.01）。表明細胞凋亡與早期糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

本研究還發(fā)現(xiàn)LC3蛋白表達量與腎小管細胞凋亡指數(shù)呈負相關（P＜0.01），且細胞自噬減弱和凋亡增多均主要發(fā)生在同一部位——腎小管。細胞自噬可以單獨通過細胞保護作用或自身破壞吞噬作用決定細胞的生存和死亡，也能通過比較復雜的機制與細胞凋亡聯(lián)系起來，從而對細胞產(chǎn)生影響。盡快地清除細胞凋亡殘余物是防止組織損傷的關鍵[8]。有研究表明自噬基因atg5缺失的胚胎同時具有凋亡細胞清除不足和組織損傷[9]。不能有效的清除凋亡細胞會引起組織對自身抗原的耐受，從而導致自身免疫性疾病[8]。細胞自噬對凋亡細胞及其產(chǎn)物的清除不足，可導致組織損傷和炎癥，這一機制可能也參與了DN的發(fā)生、發(fā)展。然而，細胞自噬在DN中的作用及其與細胞凋亡相互作用的具體機制，調(diào)高細胞自噬和減少細胞凋亡是否有助DN微血管病變的改善值得進一步研究。

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