羅洪亮 綜述，朱培謙審校

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，南昌330006）

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPK）是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)以及一些重要基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用[1]。現(xiàn)已經(jīng)確認(rèn)在哺乳動(dòng)物中存在4條不同的MAPK通路：extra－cellular signal－regulated kinase（ERK）、ERK5、c－Jun N－terminal kinase（JNK）、p38，其中JNK和P38被稱為應(yīng)激活化MAPK通路[2]。一系列的MKKs可以激活JNK和P38，如MKK3、MKK6可以激活P38，MKK7可以激活JNK，只有MKK4能同時(shí)激活JNK和P38。

研究表明JNK和P38具有腫瘤抑制作用[3]，大約5%的各種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了喪失功能的MKK4基因突變[4]。但另外一些學(xué)者的研究指出MKK4和JNK參與腫瘤的形成。這說明這條通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展扮演著復(fù)雜的角色。因此，筆者描述MKK4的生物學(xué)性狀并討論它是怎樣調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的。

1 MKK4的生物學(xué)性狀

1.1 MKK4的結(jié)構(gòu) 人的MKK4基因位于第17染色體，它編碼一條含399個(gè)氨基酸的蛋白[5]。所有哺乳動(dòng)物的MKK家族約有40%的同源性，MKK4與MKK7最為相似，大約有50%相同[6]。MKK4蛋白結(jié)構(gòu)可分為3個(gè)部分：位于N端的D域序列在信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中與JNK和P38連接；中間為激酶區(qū)（KD），包括11個(gè)亞基，7、8亞基間的S－I－A－K－T序列的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化后激活MKK4；位于C端的DVD域序列能與上游的各種MKKKs級(jí)聯(lián)（圖1）。MKK4與上下游之間的相互作用被看作是這條MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵所在[7]。

1.2 MKK4的組織分布 MKK4 m RNA廣泛的表達(dá)于成年小鼠和人體的組織中，并且在腦的表達(dá)最高，特別是在大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬體和小腦。在小鼠早期胚胎形成過程中（胚胎形成的前10d）MKK4僅局限地表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從12 d開始，MKK4開始在肝臟中表達(dá)，并與肝的分化和生長(zhǎng)發(fā)育相一致。亞細(xì)胞定位研究顯示MKK4蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，一些細(xì)胞核中也有少量表達(dá)[8]。MKK4在免疫系統(tǒng)中也起到一定的作用，但確切的作用尚不完全清楚，一組研究表明MKK4缺失會(huì)嚴(yán)重影響B(tài)細(xì)胞和T細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，但另一組研究卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯的證據(jù)表明MKK4對(duì)B、T細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育是必需的。MKK4信號(hào)傳導(dǎo)通路同樣作用于由于心肌負(fù)荷量增大引起的心肌代償性肥大[9]。

圖1 MKK4蛋白結(jié)構(gòu)

2 MKK4在MAPK的機(jī)制

2.1 上游基序激活MKK4 MKKKs通過磷酸化位于MKK4蛋白KD區(qū)域中Ser－Ile－Ala－Lys－Thr序列內(nèi)的絲氨酸／蘇氨酸殘基而激活MKK4。這些MKKKs包括促分裂素細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶激酶（MEKK）、混合酶譜激酶（MLK）、細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β（TGF－β）－活化蛋白激酶－1（TAK1）和Tp L2[10]。不同的MKKKs激活不同的MKKS，例如，MEKK1和TAK1都能磷酸化MKK4和MKK7，而MEKK4只能磷酸化MKK4，這是因?yàn)镸EKK1能連接到MKK4和MKK7都有的C－末端DVD位點(diǎn)上，而MEKK4只能特異性地連接到MKK4。一個(gè)關(guān)于MEKK1，MKK4，JNK的連續(xù)二聚交互體信號(hào)傳導(dǎo)通路模型已被提出，即MEKK1結(jié)合MKK4并使之磷酸化，然后再脫離MKK4；活化的MKK4連接到JNK并使之磷酸化。除了MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中各成分之間的直接相互作用之外，其相關(guān)的支架蛋白也能通過改變這條通路的成分和促進(jìn)他們的激活來調(diào)節(jié)這條通路。

2.2 MKK4激活JNK和P38 MKK4是MKKS家族中惟一能同時(shí)磷酸化和激活JNK和P38通路的激酶，并且MKK4能激活所有的JNK亞型（JNK1、JNK2、JNK3）和部分P38亞型（p38a、p38b）。

圖2 MKK4促細(xì)胞凋亡的機(jī)制

2.2.1 MKK4－JNK調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡 對(duì)于JNK通路，一些體外的研究提示MKK4能磷酸化JNK酪氨酸殘基，而MKK7能磷酸化蘇氨酸殘基，這些結(jié)果就引出了一個(gè)關(guān)于MKK4，MKK7協(xié)同激活JNK通路的假說。一些利用特定缺失MKK4和MKK7的小鼠胚胎干細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的研究也支持這個(gè)假說，這些研究同時(shí)顯示不同的刺激可以有差別的利用的MKK4和MKK7：在MKK7缺失的胚胎成纖維細(xì)胞中，JNK對(duì)細(xì)胞炎性因子、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）和白細(xì)胞介素－1等刺激所引起的激活效應(yīng)幾乎完全消失，而在MKK4缺失的細(xì)胞中，其激活效應(yīng)降低50%。這就說明在這些因素引起的JNK激活效應(yīng)中MKK7是必須的，而MKK4則是選擇性的；以此相對(duì)的，在應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的刺激（紫外線、熱休克、滲透壓變化）引起的JNK激活效應(yīng)，MKK4、MKK7表現(xiàn)出相似的作用[11]。

JNK通路一直被認(rèn)為與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡有關(guān)，但它的機(jī)制還不是完全清楚。目前提出了兩個(gè)假說來解釋JNK如何調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。第一個(gè)假說是，JNK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，它通過在線粒體水平激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑的促凋亡蛋白并且誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，然后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡。JNK能直接磷酸化并激活含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白Bim、Bmf，使它們從細(xì)胞骨架上脫落下來并從新分配到線粒體膜上，引起線粒體膜的通透性改變并釋放細(xì)胞色素C。JNK調(diào)節(jié)紫外線誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)支持這個(gè)假說，缺失JNK的成纖維細(xì)胞能完全抵抗紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且明顯減少細(xì)胞色素C的釋放，而該細(xì)胞的由Fas／CD95介導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡途徑不受影響[12]。另外一種假說是，JNK對(duì)外源性細(xì)胞凋亡途徑起調(diào)節(jié)作用，如對(duì)Fas－FADD－caspase和TNFRITRADD－FADD－caspase通路的調(diào)節(jié)，但只起促進(jìn)作用而不是啟動(dòng)作用。JNK的持續(xù)活化是TNFa介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所必需的，JNK的持續(xù)活化對(duì)一些抗細(xì)胞凋亡分子如c FLIP（細(xì)胞型FADD樣白細(xì)胞介素－1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白）的失活是必要的。在這些調(diào)節(jié)過程中，JNK是通過影響細(xì)胞對(duì)活化AP－1家族（cJun、cFos等）產(chǎn)生的反應(yīng)來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。這些通路中的JNK的濃度和持久度決定了細(xì)胞在接受外源性調(diào)往信號(hào)的刺激時(shí)是否會(huì)凋亡[13]（圖2）。

2.2.2 MKK4－P38與細(xì)胞周期 越來越多的研究表明，MKK4能激活P38進(jìn)而參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，在用MKK4缺陷胚胎成纖維細(xì)胞研究P38是否有激活障礙的實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)受到的刺激是TNF和白細(xì)胞介素－1的時(shí)候，P38的活化明顯受限。在缺乏特異性激活P38的MKK3，MKK6的胚胎成纖維細(xì)胞中，MKK4接受紫外線的刺激能激活P38的實(shí)驗(yàn)也證明MKK4能激活P38。在這個(gè)試驗(yàn)中還觀察到可以通過改變MKK4的水平來調(diào)節(jié)P38活化反應(yīng)的強(qiáng)弱。與MKK4激活JNK過程中先是酪氨酸殘基磷酸化不同的是，MKK4激活P38過程中是酪氨酸，蘇氨酸殘基同時(shí)磷酸化[14]。MKK4激活P38后通過兩條途徑來遏止細(xì)胞周期進(jìn)程，一條是直接磷酸化并抑制cdc25B分子，使CyclinB／cdc2復(fù)合物不能被激活，阻止進(jìn)入有絲分裂。這種機(jī)制在腫瘤細(xì)胞周期阻滯中非常重要：紫外線和烷化劑類化療藥物能介導(dǎo)這種依賴P38的G1／S或G2／M細(xì)胞周期停滯通路[15]。另外一條和JNK一樣通過調(diào)控細(xì)胞周期基因的表達(dá)使細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡。JNK和P38都能通過磷酸化活化蛋白－1家族（AP－1）轉(zhuǎn)錄因子的c－Jun，ATF－2，MEF2C亞基來調(diào)節(jié)AP－1的活性，而一些細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白包括Cyclin D1、p53、p21Cip1、p16INK4A、p19Arf都被認(rèn)為是被AP－1調(diào)節(jié)的靶基因，這些基因的編碼產(chǎn)物都參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和DNA損傷反應(yīng)[16]。

3 MKK4與腫瘤

過去的研究表明MKK4對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的起調(diào)節(jié)作用，MKK4是腫瘤抑制基因或是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，但也有一部分研究提示它是親癌基因。這說明MKK4和它下游的JNK、P38在腫瘤的進(jìn)展過程中有著更為復(fù)雜的作用。

3.1 MKK4基因的突變對(duì)腫瘤的抑制作用 抑癌基因的缺失或是失活會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展，MKK4作為抑癌基因的最早在1997年，有研究發(fā)現(xiàn)2株胰腺癌和肺癌細(xì)胞株均缺失能編碼MKK4的基因位點(diǎn)。并且他們對(duì)88株來自結(jié)腸癌，乳腺癌、胰腺癌、睪丸癌的細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)MKK4基因發(fā)生了2種無(wú)意義的突變和3種錯(cuò)義的突變，而這些突變導(dǎo)致一些MKK4蛋白的關(guān)鍵亞基無(wú)法合成或者具有重要功能的氨基酸被替換致使無(wú)法磷酸化JNK。另一個(gè)支持MKK4具有腫瘤抑制作用的是MKK4基因顯性無(wú)意義的突變能促使胚胎干細(xì)胞變異并提高致瘤性。近年的研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性的胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌MKK4基因的錯(cuò)義或無(wú)義的突變率為約。同樣的突變?cè)诜伟﹥?nèi)也發(fā)現(xiàn)。另外在對(duì)胰腺癌的研究中還發(fā)現(xiàn)MKK4（＋）的胰腺癌患者的死亡率只有MKK4（－）胰腺癌患者的一半，MKK4與存活時(shí)間相關(guān)[17]。

3.2 MKK4的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用 MKK4同樣與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在正常前列腺上皮組織中有高水平的MKK4蛋白表達(dá)，前列腺腫瘤組織中MKK4表達(dá)顯著降低，并且發(fā)現(xiàn)MKK4的低水平表達(dá)與轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。有研究將具有高度轉(zhuǎn)移性的小鼠前列腺癌細(xì)胞株AT6.1（缺乏MKK4表達(dá)）和轉(zhuǎn)染了MKK4的該種細(xì)胞株（AT6.1－MKK4）注入到重度聯(lián)合免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，觀察他們的肺轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示與AT6.1（缺乏MKK4表達(dá)）的小鼠相比，AT6.1－MKK4的小鼠肺肉眼轉(zhuǎn)移灶明顯減少，并且存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，而原發(fā)腫瘤灶無(wú)明顯差異。說明了MKK4具有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用。同時(shí)，在AT6.1－MKK4的小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)了微轉(zhuǎn)移灶提示腫瘤細(xì)胞已從原發(fā)灶逃離但在肺里的生長(zhǎng)得到抑制。此外，JNK另外一個(gè)激活體MMK7，也能通過抑制AT6.1細(xì)胞在肺的克隆來抑制轉(zhuǎn)移；而P38的激活者M(jìn)KK6卻不能，說明MKK4是通過介導(dǎo)JNP通路來抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移。最近Victoria等[18]提出腫瘤細(xì)胞內(nèi)MKK4蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)是在MKK4 m RNA翻譯MKK4蛋白階段的假說，他們用PCR和免疫印跡法檢測(cè)了人類PC3、LNCaP、C4－2、DuPro和DU145前列腺癌細(xì)胞株，SKOV3ip.1、SKOV3、CaOV3、Hey A8卵巢癌細(xì)胞株，Hela宮頸癌細(xì)胞株的MKK4蛋白表達(dá)量和MKK4 mRNA量并以小鼠腦細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，不表達(dá)MKK4的ASPC－1胰腺癌細(xì)胞株作為陰性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些不同細(xì)胞的細(xì)胞核中MKK4蛋白和MKK4 mRNA都沒有明顯的差異，而在胞漿中，MKK4高表達(dá)細(xì)胞的MKK4蛋白量和MKK4 mRNA量都明顯高于MKK4低表達(dá)細(xì)胞，提示MKK4表達(dá)的調(diào)控在翻譯階段。

Yamada等[19]的研究發(fā)現(xiàn)與正常的卵巢上皮細(xì)胞相比，卵巢癌細(xì)胞的MKK4蛋白表達(dá)同樣降低了，并且MKK4蛋白表達(dá)水平高的卵巢癌轉(zhuǎn)移能力較MKK4缺乏的明顯降低并且存活期延長(zhǎng)了70%。將人類卵巢癌細(xì)胞株SKOV3ip.1（很少表達(dá)MKK4蛋白）和轉(zhuǎn)染了MKK4的SKOV3ip.1細(xì)胞株注射到免疫缺陷的小鼠腹腔中，30d后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了MKK4的SKOV3ip.1細(xì)胞株引起的網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶較無(wú)MKK4的降低了88%[20]。

還有研究表明MKK4對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制的調(diào)控可能是通過降低腫瘤細(xì)胞的黏附作用、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)的。實(shí)時(shí)定量PCR顯示注入癌細(xì)胞株后第3天在網(wǎng)膜上出現(xiàn)的兩組癌細(xì)胞并無(wú)明顯差別；用鏡下觀察和免疫組化法檢測(cè)的兩組微小轉(zhuǎn)移灶也無(wú)明顯差別。用Brd U（S期標(biāo)記物）和p H3（M期標(biāo)記物）同時(shí)標(biāo)記到兩組微轉(zhuǎn)移灶的癌細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記了Brd U和p H3的SKOV3ip.1－MKK4癌細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染MKK4的明顯減少，提示SKOV3ip.1－MKK4細(xì)胞很少通過細(xì)胞周期中的S、M期而處于休眠期或是凋亡狀態(tài)。而在SKOV3ip.1－MKK4細(xì)胞中細(xì)胞周期抑制蛋白p21明顯增高，約是對(duì)照組的10倍[21]。在另外一個(gè)卵巢癌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校l(fā)現(xiàn)p38的另一個(gè)激活者M(jìn)KK6同樣能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，而JNK的另一激活者M(jìn)KK7卻不能，說明MKK4是通過介導(dǎo)p38通路來抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移。這些研究說明MKK4在不同的器官和不同的環(huán)境下通過介導(dǎo)不同的MAPK通路來發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用。

3.3 MKK4的親癌性 并不是所有有關(guān)MKK4的研究都支持MKK4基因?yàn)橐职┗?，同樣，也有一部分?shí)驗(yàn)說明MKK4具有促癌作用。在一些缺乏內(nèi)源性MKK4的乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞株經(jīng)異位表達(dá)的MKK4刺激后腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲力都明顯增強(qiáng)。相反的，用siRNA技術(shù)敲除MMK4陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株的MKK4基因后發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的非停泊性生長(zhǎng)減弱，細(xì)胞凋亡易感性和抑制腫瘤生長(zhǎng)能力增強(qiáng)。另外，而人支氣管上皮細(xì)胞株MKK4基因有意義的突變能增加細(xì)胞的增殖能力和侵襲力。這些研究都提示MKK4的親癌性。

此外，Cunningham等[22]用特異性靶向斷裂胰腺癌細(xì)胞株P(guān)L5的MKK4基因的實(shí)驗(yàn)同樣論證了MKK4的促癌作用。靜脈注射原代PL5細(xì)胞或是MKK4（＋）的小鼠，有大部分的小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；而注射MKK4的小鼠只有少數(shù)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。當(dāng)皮下注射MKK4（－）PL5時(shí)，小鼠腫瘤的體積翻倍時(shí)間較注射原代PL5或MKK4（＋）的明顯延長(zhǎng)，都提示MKK4促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。在促癌作用機(jī)制中MKK4主要通過介導(dǎo)JNK通路來促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。Huang等[23]用免疫組化和RT－PCR技術(shù)對(duì)多例喉鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)喉鱗癌組織MKK4的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于癌旁正常組織MKK4的表達(dá)，并且MKK4的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。Finegan和Tournier[24]建立了一種新的小鼠模型，即用致癌物誘導(dǎo)特異性缺失MKK4的表皮生成乳頭狀瘤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性缺失MKK4表皮的小鼠能抵抗腫瘤發(fā)生。其機(jī)制是MKK4通過激活JNK信號(hào)通路來增加表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤形成?？傊@些研究表明MKK4對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)方式取決于不同的條件，并且能根據(jù)不同的組織類型、不同環(huán)境以及與其他的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的相互作用選擇不同的途徑。

4 展 望

MKK4作為MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的構(gòu)成部分，在調(diào)節(jié)不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展所到作用差異性提示它在調(diào)節(jié)過程中可能涉及到多種因子的共同作用，存在著極為復(fù)雜的機(jī)制，人們的認(rèn)識(shí)并不是十分清楚。因此，還需通過建立合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停訌?qiáng)對(duì)MKK4的研究，進(jìn)一步了解它在不同腫瘤的發(fā)病中機(jī)制，明確它與不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，為腫瘤的早期診斷和個(gè)體化靶向治療奠定基礎(chǔ)。

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