宋璐非 劉 冰 趙 勇 田景振 秦 松

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所生物資源實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái) 264003；3.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000

天然藻藍(lán)蛋白對(duì)SD大鼠的長(zhǎng)期毒性研究

宋璐非1劉 冰2趙 勇3田景振1秦 松2

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所生物資源實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái) 264003；3.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000

目的 研究天然藻藍(lán)蛋白對(duì)SD大鼠的長(zhǎng)期毒性。 方法 將天然藻藍(lán)蛋白水溶液分為高、中、低3個(gè)劑量與蒸餾水對(duì)照，對(duì)80只SD大鼠連續(xù)灌胃12周，恢復(fù)4周。除觀察動(dòng)物一般狀態(tài)外，第12、16周分別對(duì)給藥末期大鼠及恢復(fù)期結(jié)束的大鼠進(jìn)行連續(xù)處死，檢測(cè)血常規(guī)、血生化指標(biāo)，精密量取心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，計(jì)算其臟器系數(shù)，并進(jìn)行常規(guī)病理檢查。 結(jié)果 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)大鼠的一般狀態(tài)、血常規(guī)、血生化指標(biāo)、主要臟器質(zhì)量系數(shù)及組織病理均無(wú)明顯影響。停藥4周后上述結(jié)果未見(jiàn)明顯異常。與空白對(duì)照組比較，未見(jiàn)與天然藻藍(lán)蛋白相關(guān)的明顯異常。結(jié)論大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)表明天然藻藍(lán)蛋白口服無(wú)毒性。

天然藻藍(lán)蛋白；SD大鼠；長(zhǎng)期毒性

藻藍(lán)蛋白（Phycocyanin）是從螺旋藻中提取的天然捕光色素蛋白，屬于藻膽蛋白（Phycobiliprotein）的一種。Romay等[1]第一次報(bào)道從藍(lán)藻中提取的藻藍(lán)蛋白具有抗氧化和抗炎作用，藻藍(lán)蛋白還能抑制肝臟微粒脂過(guò)氧化物生成（IC50=12 mg/mL）。此外藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的抗氧化活性也相繼被證實(shí)[2-4]。Morcos等[5]首先發(fā)現(xiàn)了藻藍(lán)蛋白的激光致細(xì)胞毒作用并對(duì)骨髓造血具有刺激作用。現(xiàn)已證實(shí)藻藍(lán)蛋白能在適宜波長(zhǎng)光的激發(fā)下，產(chǎn)生單線態(tài)氧和其他的氧自由基[6]用于腫瘤細(xì)胞光動(dòng)力治療。最近報(bào)道顯示藻藍(lán)蛋白對(duì)人肺腺同樣有抑制作用[7]。在國(guó)內(nèi)，劉宇峰等[8]證明螺旋藻藻藍(lán)蛋白（C-PC）對(duì)K562（白血?。┘?xì)胞的抑制效果良好。關(guān)燕清等[9]發(fā)現(xiàn)固定在聚苯乙烯（PSt）基板上藻藍(lán)蛋白對(duì)體外肝癌細(xì)胞7402有抑制作用。目前對(duì)藻藍(lán)蛋白的各種藥理藥效學(xué)研究已經(jīng)積累了大量數(shù)據(jù)可供參考并且展示了開(kāi)發(fā)成各種功能食品及藥物的良好前景，但對(duì)其毒理學(xué)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)用自提天然藻藍(lán)蛋白對(duì)SD大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究，為以后開(kāi)發(fā)藻藍(lán)蛋白為主要成分的功能食品和藥物提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 受試藥物的制備

食品級(jí)螺旋藻粉購(gòu)自江蘇賜百年公司，藻藍(lán)蛋白從螺旋藻中提取[10]，純度 1.0（A620/A280）。

1.2 受試動(dòng)物與飼養(yǎng)條件

SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自綠葉制藥[SCXK（魯）20090009]。80只，雌雄各半，6～9周齡。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，動(dòng)物身體健康，無(wú)異常狀況，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體質(zhì)量差異不超過(guò)±20%。

飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于塑料籠（350mm×24 mm×170 mm）內(nèi)，每籠 1只。室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度 50%～70%，控制光 12 h，黑暗12 h。自由取水和食料，定期更換墊料。

1.3 設(shè)備與試劑

CA-500血球計(jì)數(shù)儀（AITAIKE），溶血素（山東蘭橋醫(yī)學(xué)科技有限公司），稀釋液 （煙臺(tái)卓越生物技術(shù)有限公司），TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀（東芝，日本），檢測(cè)試劑（中生北控生物科技股份有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

將80只SD大鼠按體重隨機(jī)分為蒸餾水對(duì)照組與高、中、低三個(gè)劑量組，共4組，每組20只，雌雄各10只。

2.2 給藥途徑與劑量設(shè)計(jì)

灌胃，每次口服容量 1mL/（100 g·d）。

根據(jù)天然藻藍(lán)蛋白經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，12 g/kg無(wú)毒性反應(yīng)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定SD大鼠天然藻藍(lán)蛋白長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)高劑量組為4.00 g/kg，中劑量組為0.40 g/kg，低劑量組為0.12 g/kg，對(duì)照組為蒸餾水。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

檢測(cè)指標(biāo)及時(shí)間見(jiàn)表1。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

各組動(dòng)物發(fā)育良好，皮毛光澤，行為正常，大小便與對(duì)照組無(wú)差異，眼、鼻無(wú)異常分泌物，攝食正常。恢復(fù)期4周內(nèi)無(wú)異常表現(xiàn)。連續(xù)給藥12周及恢復(fù)期4周各組體質(zhì)量逐周增加，各組體質(zhì)量增長(zhǎng)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥12周及停藥4周，各給藥組大鼠的進(jìn)食量與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 對(duì)大鼠外周血常規(guī)的影響

給藥12周末次給藥24 h后，連續(xù)處死大鼠，腹腔動(dòng)脈取血。血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，給藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、3?；謴?fù)期4周末次給藥24 h后，重復(fù)以上試驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.3 對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

給藥12周末次給藥24 h后連續(xù)處死大鼠，腹腔動(dòng)脈取血后靜置30min，3 000 r/min離心10 min后去上清液，得到血清進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢查。結(jié)果與對(duì)照組比較，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、血清尿素氮（BUN）、總膽固醇（T-CHO）、血糖（GLU）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（CREA）、總膽紅素（TBIL）等含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、5。恢復(fù)期4周末次給藥24 h后，重復(fù)以上試驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 檢測(cè)時(shí)間及指標(biāo)

表2 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=6）

表2 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=6）

組別 劑量（g/kg） 雌性給藥12周RBC（1012/L） Hb（g/L） PLT（109/L） WBC（109/L） N（%） L（%）蒸餾水對(duì)照組藻藍(lán)蛋白低劑量組藻藍(lán)蛋白中劑量組藻藍(lán)蛋白高劑量組-0.12 0.40 4.00 8.16±1.00 7.86±1.62 9.07±1.70 8.83±1.27 161.64±19.30 157.89±21.56 150.37±24.98 172.43±26.77 876.55±139.39 913.36±159.58 826.93±148.63 896.50±123.39 6.02±1.54 5.22±1.95 5.89±1.23 5.13±2.01 75.93±15.73 83.58±17.65 79.35±16.08 80.78±20.01 20.31±15.43 22.40±17.02 19.21±16.88 25.34±20.10

表3 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=6）

表3 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=6）

組別 劑量（g/kg） 雄性給藥12周RBC（1012/L） Hb（g/L） PLT（109/L） WBC（109/L） N（%） L（%）蒸餾水對(duì)照組藻藍(lán)蛋白低劑量組藻藍(lán)蛋白中劑量組藻藍(lán)蛋白高劑量組-0.12 0.40 4.00 9.20±1.08 9.77±1.49 8.20±1.38 9.53±1.36 169.54±29.22 173.81±22.79 155.63±32.12 168.53±27.12 935.30±166.19 850.52±183.37 822.30±176.54 900.00±170.82 7.70±2.75 7.58±2.89 8.03±3.08 8.14±3.25 76.53±15.67 79.78±17.84 80.82±18.33 88.72±18.79 24.39±15.29 21.57±13.67 19.76±16.69 28.50±19.24

表4 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)雌性大鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=6）

表4 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)雌性大鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=6）

檢測(cè)指標(biāo) 雌性給藥12周藻藍(lán)蛋白低劑量組（0.12 g/kg） 藻藍(lán)蛋白中劑量組（0.40 g/kg）藻藍(lán)蛋白高劑量組（4.00 g/kg）蒸餾水對(duì)照組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT，U/L）天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST，U/L）堿性磷酸酶（ALP，U/L）總蛋白（TP，g/L）白蛋白（ALB，g/L）尿素氮（BUN，mmol/L）肌酐（CREA，μmol/L）血糖（GLU，mmol/L）三酰甘油（TG，mmol/L）總膽固醇（T-CHO，mmol/L總膽紅素（TBIL，mmol/L）肌酸激酶（CK，mmol/L）60.13±23.33 188.38±54.04 72.88±50.44 69.94±5.88 36.84±5.81 7.14±1.79 50.06±12.31 4.27±1.83 0.47±0.16 1.98±1.04 4.82±1.59 510.29±195.74 61.18±21.12 192.49±58.77 68.42±56.39 72.88±5.01 39.11±5.49 7.28±1.71 49.69±10.85 4.40±1.07 0.49±0.23 2.23±1.64 4.54±1.78 447.75±247.93 59.68±20.77 194.69±56.87 77.56±49.33 66.99±7.21 41.22±6.02 7.01±1.92 51.80±12.35 4.06±1.58 0.57±0.29 2.15±0.84 4.98±1.74 558.35±227.49 63.64±23.52 179.47±61.21 76.29±55.27 69.37±5.62 40.79±5.85 7.33±1.95 51.29±12.54 4.78±1.87 0.55±0.28 2.07±0.85 4.23±1.92 568.28±272.34

表5 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=6）

表5 天然藻藍(lán)蛋白對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=6）

檢測(cè)指標(biāo) 雄性給藥12周藻藍(lán)蛋白低劑量組（0.12 g/kg） 藻藍(lán)蛋白中劑量組（0.40 g/kg） 藻藍(lán)蛋白高劑量組（4.00 g/kg）蒸餾水對(duì)照組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，U/L）天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，U/L）堿性磷酸酶（ALP，U/L）總蛋白（TP，g/L）白蛋白（ALB，g/L）尿素氮（BUN，mmol/L）肌酐（CREA，μmol/L）血糖（GLU，mmol/L）三酰甘油（TG，mmol/L）總膽固醇（T-CHO，mmol/L）總膽紅素（TBIL，mmol/L）肌酸激酶（CK，mmol/L）73.69±24.12 175.89±47.88 104.07±46.98 70.13±6.12 36.96±5.12 7.27±1.87 47.25±16.51 4.28±0.93 0.55±0.15 1.87±0.56 4.43±2.17 743.53±242.56 74.69±22.17 181.43±48.64 110.58±43.94 67.12±5.95 38.25±5.70 7.40±1.92 45.71±16.98 4.17±0.98 0.59±0.18 1.77±0.58 4.76±2.04 710.53±293.06 75.79±25.41 169.69±50.34 117.09±47.15 69.54±6.17 36.84±5.92 7.45±1.97 45.00±17.62 4.09±1.02 0.66±0.23 1.75±0.61 4.55±2.11 684.50±310.54 72.11±23.62 173.32±43.75 117.88±48.60 70.33±5.80 37.51±5.83 7.36±1.98 48.50±16.68 4.40±1.13 0.64±0.21 1.91±0.62 4.58±2.09 773.53±294.24

3.4 對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

大鼠給藥第12周后和恢復(fù)至16周時(shí)，解剖取心、肺、肝、脾、腎、腦、腎上腺、胸腺、睪丸/卵巢和前列腺/子宮，稱其絕對(duì)重量并計(jì)算以上器官各占100 g體質(zhì)量的相對(duì)重量。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白不影響動(dòng)物臟器重量。

3.5 對(duì)大鼠重要臟器病理組織學(xué)檢查

第12周解剖時(shí)，取心、肺、肝、脾、腎、腦、甲狀腺、腎上腺、胸腺、副睪、前列腺/子宮和睪丸/卵巢、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、胰腺、眼球及視神經(jīng)、胸骨和骨髓，肉眼觀察其外觀和形態(tài)，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HE染色后，光鏡下觀察各劑量給藥組大鼠器官組織結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)組織萎縮、增長(zhǎng)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯的與受試物相關(guān)的病理性損傷?；謴?fù)至16周時(shí)各給藥組以上組織器官與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討論

本研究用自提天然藻藍(lán)蛋白對(duì)SD大鼠進(jìn)行系統(tǒng)的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究。結(jié)果顯示，天然藻藍(lán)蛋白以4.00、0.40、0.12 g/kg的劑量，對(duì)SD大鼠連續(xù)灌胃給藥12周，對(duì)大鼠的體質(zhì)量、飲食、飲水無(wú)不良影響；定期檢測(cè)的RBC、PLT、WBC血常規(guī)以及 ALT、AST、ALP、TBIL、CREA 等血液生化指標(biāo)都在正常范圍內(nèi)，并且與灌胃樣品量無(wú)劑量依賴相關(guān)性，無(wú)明顯的血常規(guī)毒性；對(duì)肝、脾、腎等重要臟器組織結(jié)構(gòu)以及主要臟器系數(shù)的觀察，未見(jiàn)明顯腫脹、壞死以及炎癥反應(yīng)，綜合以上結(jié)果表明樣品口服無(wú)肝臟毒性。經(jīng)過(guò)4周恢復(fù)期后檢測(cè)上述各指標(biāo)均未見(jiàn)明顯異常，并且高、中、低劑量組數(shù)據(jù)與蒸餾水對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示上述指標(biāo)在停止灌胃后未見(jiàn)其他明顯的后遺效應(yīng)和繼發(fā)毒性變化。對(duì)比已有的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，天然藻藍(lán)蛋白口服無(wú)毒性，屬于實(shí)際無(wú)毒物，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為功能食品和藥物的價(jià)值。

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Chronic toxicity study of Phycocyanin on Sprague Daw ley rats

SONG Lufei1 LIU Bing2 ZHAO Yong3 TIAN Jingzhen1 QIN Song2
1.School of Pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong Province,Ji′nan 250355,China;2.Biological Resources Laboratory,Yantai Institute of Coastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Shandong Province,Yantai 264003,China;3.College of Life Sciences,YantaiUniversity,Shandong Province,Yantai 264000,China

Objective To investigate the chronic toxicity induced by oral administration of Phycocyanin to Sprague Dawley rats.MethodsRats were randomly divided into four groups:control group,which

the distilled water,and three treatmentgroups,which received oral administration of high,medium and low doses of Phycocyanin.Totally 80 SD ratswere continuously administrated for 12 weeks,and then recovered for 4 weeks.Except for general factors such as bodyweight,food consumption and daily behavior,the routine biochemical blood indictors,the organ/bodyweight rate,the pathological changes of important organs such as heart,liver,spleen,lung,kidney,brain were also detected after 12 weeks and 16 weeks.The viscera coefficientwas calculated,and pathologicalwas examed routinely.ResultsThere was no significant influence of Phycocyanin on the blood routine,serum indictors and organ/bodyweight rate of the three dose group rats.ConclusionTheResultsof long-term toxicity experiment show that oral administration of Phycocyanin is safe.

Phycocyanin;SD Rats;Chronic toxicity

R948

A

1673-7210（2012）11（c）-0015-04

國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201205027）。

宋璐非（1985-），男，山東濟(jì)南人，碩士研究生，主要從事中藥新藥、新劑型的研究。

田景振，教授，博士生導(dǎo)師；秦松，研究員，博士生導(dǎo)師。

2012-06-27 本文編輯：衛(wèi) 軻）