單曉楓，吳同壘，孟慶峰，王偉利，錢愛東

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118;2 吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林長(zhǎng)春 130062）

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii，AV)隸屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種人－獸－魚共患病原菌.其不僅在人抵抗力下降時(shí)，感染機(jī)體引發(fā)人的壞死性腦炎、敗血癥、腹瀉等疾?。?－3］;而且也可引發(fā)水生動(dòng)物的疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失［4－6］.AV 有多種毒力因子，主要包括外毒素、蛋白酶、鞭毛、外膜蛋白等，其中，鞭毛作為大多數(shù)細(xì)菌的主要運(yùn)動(dòng)器官，在細(xì)菌致病性方面，起著舉足輕重的作用.目前，國(guó)內(nèi)AV的研究正處于起步階段，本研究以框鏡鯉Cyprinus carpio AV CY0806為研究對(duì)象，克隆其鞭毛flaA基因，并對(duì)其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以期為框鏡鯉AV的發(fā)病機(jī)理、基因工程疫苗等研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

框鏡鯉AV CY0806株分離自患病框鏡鯉，為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室保存;大腸埃希菌Escherichia coli DH5α為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究室保存;pMD18－T vector為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品.

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;DNA凝膠回收試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小量抽提試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;氣單胞菌培養(yǎng)基RS為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的AV鞭毛flaA基因序列，應(yīng)用Primer Premer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物:上游引物 P1:5'－GCGGAATTCATGGGCCTTTATATCA－3'，下游引物 P2:5'－ACGAAGCTTTTAGCCTTGCCAACAGA－3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng) 915 bp，該引物由寶生物工程(大連)有限公司合成.

1.4 鞭毛flaA基因的PCR擴(kuò)增

將低溫保存的AV CY0806劃線接種于RS培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，挑取特征菌落接種于普通LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)18 h，取1 mL菌液，提取細(xì)菌基因組DNA，具體操作參照細(xì)菌基因組DNA提取手冊(cè).以菌株CY0806基因組DNA為模板，P1、P2為引物，采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增flaA基因，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min、58℃1 min、72℃ 1 min、循環(huán)32次，最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物于4℃保存.

1.5 鞭毛flaA基因的克隆及鑒定

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.01 kg/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，并與pMD18－T verctor連接，轉(zhuǎn)化至 DH5α 感受態(tài)細(xì)菌.將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)菌落、增菌，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定.

1.6 鞭毛flaA基因的序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將所測(cè)flaA基因序列用Blastn進(jìn)行比對(duì)，并從NCBI上下載氣單胞菌屬不同菌種的flaA基因，應(yīng)用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.7 鞭毛flaA基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

將flaA基因開放閱讀框錄入DNAStar的Editseq工作區(qū)，用Translate DNA功能翻譯flaA氨基酸序列;利用 http:∥www.expasy.org/cgi－bin/protparam預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì);利用 SingalP v 3.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/sercices/SingalP)對(duì)氨基酸序列信號(hào)肽進(jìn)行分析;利用TMHMM v 2.0(http:∥genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM－2.0)對(duì)序列跨膜區(qū)分析;利用BioEdit和DNAStar分析序列親水性和疏水性;利用DNAStar軟件的Proteam分析氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用 Swiss－Model Workspace(http:∥swissmodel.expasy.org/wokspace)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)做同源建模.

2 結(jié)果與分析

2.1 鞭毛flaA基因的PCR擴(kuò)增和鑒定

以菌體基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約915 bp的特異性條帶(圖1).將擴(kuò)增的flaA基因片段純化后與pMD18－T verctor連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后，陽(yáng)性重組質(zhì)粒通過PCR鑒定，得到與目的基因大小一致的片段(圖2).

圖1 框鏡鯉AV CY0806 flaA基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplified flaA gene from Cyprinus carpio AV CY0806 by PCR

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.2 鞭毛flaA基因的序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

經(jīng)序列測(cè)定，flaA基因全長(zhǎng)915 bp，編碼304個(gè)氨基酸.序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖3)結(jié)果表明:維氏氣單胞菌CY0806株flaA基因與維氏氣單胞菌EU410309和EU410323的flaA基因進(jìn)化距離近.

圖3 框鏡鯉AV CY0806 flaA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Cyprinus carpio AV CY0806 flaA gene

2.3 鞭毛flaA基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 鞭毛flaA基因編碼蛋白分子特征 鞭毛flaA基因編碼蛋白推導(dǎo)相對(duì)分子質(zhì)量32098.66，含有23個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K、R)、24個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D、E)、105 個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、121 個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)，等電點(diǎn)為 5.57，推測(cè)分子式C1853H2229N409O474S9，消化系數(shù)7450，半衰期為30 h(體外哺乳動(dòng)物類網(wǎng)狀細(xì)胞)、大于20 h(在酵母體內(nèi))及10 h(在大腸埃希菌體內(nèi))，不穩(wěn)定系數(shù)32.31(穩(wěn)定蛋白)，脂肪系數(shù)81.05.

2.3.2 鞭毛flaA基因編碼蛋白的信號(hào)肽與跨膜區(qū)分析 通過SingalP軟件預(yù)測(cè)分析，鞭毛flaA基因編碼蛋白分子無信號(hào)肽;TMHMM分析結(jié)果顯示:此蛋白分子不存在跨膜區(qū).

2.3.3 鞭毛flaA基因編碼蛋白的親水性和疏水性分析 利用BioEdit和DNAStar分析:鞭毛flaA基因編碼蛋白最大疏水指數(shù)1.86，最小疏水指數(shù)－2.68;最大親水指數(shù)2.68，最小親水指數(shù)－1.86.其分析結(jié)果如圖4所示.

2.3.4 鞭毛flaA基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過Gamier－Robso方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，鞭毛flaA基因編碼蛋白分子存在11處α螺旋、21處β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲則相對(duì)較少;而應(yīng)用Chou－Fasman方法，發(fā)現(xiàn)有10處 α 螺旋、11處 β 折疊、β轉(zhuǎn)角則多至18處.

2.3.5 鞭毛flaA基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將推導(dǎo)的氨基酸序列利用Swiss－Model Workspace進(jìn)行同源建模，以第2～303位氨基酸序列預(yù)測(cè)鞭毛flaA基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖5).

圖4 框鏡鯉AV CY0806 flaA蛋白的疏水性和親水性分析Fig.4 Hydrophilicity prediction and hydrophobicity prediction of Cyprinus carpio AV CY0806 flaA

圖5 flaA三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 3D structure prediction of flaA

3 討論

維氏氣單胞菌作為一種較新型的人－獸－魚共患病原菌，在引發(fā)人的各種疾病的同時(shí)，近年來，已有相當(dāng)多的報(bào)道，證明其可以感染多種水生動(dòng)物并引發(fā)多種疾病的流行.本研究所用菌株即為框鏡鯉敗血癥病原菌［7］，該菌株經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，可以感染多種魚類并引起相應(yīng)的病癥，但其發(fā)病機(jī)理尚不清楚.而鞭毛作為多種細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，在細(xì)菌感染、免疫等方面發(fā)揮重要作用，其主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)，具有良好的免疫原性.目前，從基因水平研究病原菌的鞭毛，是研究病原菌致病的分子機(jī)制和研發(fā)基因工程疫苗的基礎(chǔ)［8－9］.為此，本試驗(yàn)對(duì)框鏡鯉源 AV鞭毛flaA基因進(jìn)行了克隆并對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)的分析.

本研究從框鏡鯉AV CY0806株中克隆了flaA基因，經(jīng)PCR與測(cè)序分析，成功地獲得了長(zhǎng)915 bp的flaA基因，其編碼304個(gè)氨基酸，與其他氣單胞菌屬的菌株進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)菌株CY0806 flaA基因與 GenBank上的維氏氣單胞菌 EU410309、EU410323進(jìn)化距離較近，進(jìn)化樹在同一分支上.但也發(fā)現(xiàn)，有部分基因存在差異，可能與菌株來源、地域差異有很大關(guān)系.

預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)，是了解蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)信息的重要途徑，其預(yù)測(cè)方法以同源建模、線串法和從頭建算法為主［10］，其中，同源建模法是最為成功和準(zhǔn)確的方法.本研究以同源建模法預(yù)測(cè)了flaA三維立體結(jié)構(gòu).預(yù)測(cè)結(jié)果，將有利于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使蛋白質(zhì)的相應(yīng)特性更趨于理想;另一方面還可進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，使可能成為藥物的蛋白質(zhì)更好地與受體結(jié)合，充分發(fā)揮藥物的功效［11］.

本試驗(yàn)克隆了維氏氣單胞菌CY0806株的flaA基因，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為以后研究維氏氣單胞菌的發(fā)病機(jī)制、診斷方法的建立及研發(fā)疫苗以預(yù)防由AV引起的疾病提供了理論依據(jù)，為更好地研究這一新型人－獸－魚共患病原菌奠定了基礎(chǔ).

［1］SHIINA Y，LI K，IWANAGA M.An Aeromonas veronii biovar sobria infection with disseminated intravascular gas production［J］.J Infect Chemother，2004，10(1):37－41.

［2］GRBNER S，BISSINGER A L，RAIBLE A，et al.Severe diarrhea caused by Aeromonas veronii biovar sobria in a patient with metastasised GIST［J］.Polish Journal of Microbiology，2007，56(4):277－279.

［3］CUI Hong－yi，HAO Sun－yang，AROUS E.A distinct cause of necrotizing fasciitis:Aeromonas veronii biovar sobria［J］.Surgical Infections，2007，8(5):523－528.

［4］RAHMAN M，COLQUE－NAVARRO P，KLIHN I，et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh［J］.Applied Environmental Microbiology，2002，68(2):650－655.

［5］房海，陳翠珍，張曉君，等.中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗(yàn)［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(1):45－49.

［6］潘曉藝，沈錦玉，李建應(yīng)，等.青蝦“軟殼綜合癥”病原及其特性［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(10):1571－1576.

［7］龔倩，高淑琴，單曉楓，等.框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(12):981－983.

［8］MARUYAMARU Y，MOMMA M，MIKAMI B，et al.Crystal structure of novel bacterial cell－surface flagellin binding to a polysaccharide［J］.Biochemistry，2008，47(5):1393－1402.

［9］YONEKURA K，MAKI S，NAMBA K.Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy［J］.Nature，2003，424(32):643－650.

［10］薛慶中.DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，2010.

［11］翟軍軍，竇永喜，張海瑞，等.小反芻獸疫病毒P基因的克隆及其結(jié)構(gòu)與功能分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(11):2355－2362.