單曉楓,吳同壘,孟慶峰,王偉利,錢愛東
(1 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,吉林長春 130118;2 吉林出入境檢驗檢疫局,吉林長春 130062)
維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii,AV)隸屬于弧菌科氣單胞菌屬,是一種人-獸-魚共患病原菌.其不僅在人抵抗力下降時,感染機體引發(fā)人的壞死性腦炎、敗血癥、腹瀉等疾病[1-3];而且也可引發(fā)水生動物的疾病,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[4-6].AV 有多種毒力因子,主要包括外毒素、蛋白酶、鞭毛、外膜蛋白等,其中,鞭毛作為大多數(shù)細菌的主要運動器官,在細菌致病性方面,起著舉足輕重的作用.目前,國內(nèi)AV的研究正處于起步階段,本研究以框鏡鯉Cyprinus carpio AV CY0806為研究對象,克隆其鞭毛flaA基因,并對其編碼蛋白質(zhì)進行了生物信息學分析,以期為框鏡鯉AV的發(fā)病機理、基因工程疫苗等研究奠定基礎.
框鏡鯉AV CY0806株分離自患病框鏡鯉,為吉林農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學研究室保存;大腸埃希菌Escherichia coli DH5α為吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院生物技術(shù)研究室保存;pMD18-T vector為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品.
Taq DNA聚合酶、dNTP均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;DNA凝膠回收試劑盒為愛思進生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小量抽提試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;氣單胞菌培養(yǎng)基RS為北京陸橋技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品;其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.
根據(jù)GenBank上發(fā)表的AV鞭毛flaA基因序列,應用Primer Premer 5.0和Oligo 6.0軟件設計1對引物:上游引物 P1:5'-GCGGAATTCATGGGCCTTTATATCA-3',下游引物 P2:5'-ACGAAGCTTTTAGCCTTGCCAACAGA-3',預計擴增片段長 915 bp,該引物由寶生物工程(大連)有限公司合成.
將低溫保存的AV CY0806劃線接種于RS培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)24 h,挑取特征菌落接種于普通LB液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)18 h,取1 mL菌液,提取細菌基因組DNA,具體操作參照細菌基因組DNA提取手冊.以菌株CY0806基因組DNA為模板,P1、P2為引物,采用50 μL反應體系進行PCR擴增flaA基因,反應條件:94℃預變性5 min,94℃ 1 min、58℃1 min、72℃ 1 min、循環(huán)32次,最后72℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物于4℃保存.
將PCR擴增產(chǎn)物用0.01 kg/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,并與pMD18-T verctor連接,轉(zhuǎn)化至 DH5α 感受態(tài)細菌.將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)12~16 h,挑取單個菌落、增菌,用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并進行PCR驗證,篩選出陽性重組質(zhì)粒送至寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定.
將所測flaA基因序列用Blastn進行比對,并從NCBI上下載氣單胞菌屬不同菌種的flaA基因,應用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.
將flaA基因開放閱讀框錄入DNAStar的Editseq工作區(qū),用Translate DNA功能翻譯flaA氨基酸序列;利用 http:∥www.expasy.org/cgi-bin/protparam預測蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì);利用 SingalP v 3.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/sercices/SingalP)對氨基酸序列信號肽進行分析;利用TMHMM v 2.0(http:∥genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)對序列跨膜區(qū)分析;利用BioEdit和DNAStar分析序列親水性和疏水性;利用DNAStar軟件的Proteam分析氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu);利用 Swiss-Model Workspace(http:∥swissmodel.expasy.org/wokspace)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)做同源建模.
以菌體基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴增出約915 bp的特異性條帶(圖1).將擴增的flaA基因片段純化后與pMD18-T verctor連接,經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后,陽性重組質(zhì)粒通過PCR鑒定,得到與目的基因大小一致的片段(圖2).
圖1 框鏡鯉AV CY0806 flaA基因的PCR擴增Fig.1 Amplified flaA gene from Cyprinus carpio AV CY0806 by PCR
圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR
經(jīng)序列測定,flaA基因全長915 bp,編碼304個氨基酸.序列比對與系統(tǒng)進化樹分析(圖3)結(jié)果表明:維氏氣單胞菌CY0806株flaA基因與維氏氣單胞菌EU410309和EU410323的flaA基因進化距離近.
圖3 框鏡鯉AV CY0806 flaA基因的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Cyprinus carpio AV CY0806 flaA gene
2.3.1 鞭毛flaA基因編碼蛋白分子特征 鞭毛flaA基因編碼蛋白推導相對分子質(zhì)量32098.66,含有23個強堿性氨基酸(K、R)、24個強酸性氨基酸(D、E)、105 個疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、121 個極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y),等電點為 5.57,推測分子式C1853H2229N409O474S9,消化系數(shù)7450,半衰期為30 h(體外哺乳動物類網(wǎng)狀細胞)、大于20 h(在酵母體內(nèi))及10 h(在大腸埃希菌體內(nèi)),不穩(wěn)定系數(shù)32.31(穩(wěn)定蛋白),脂肪系數(shù)81.05.
2.3.2 鞭毛flaA基因編碼蛋白的信號肽與跨膜區(qū)分析 通過SingalP軟件預測分析,鞭毛flaA基因編碼蛋白分子無信號肽;TMHMM分析結(jié)果顯示:此蛋白分子不存在跨膜區(qū).
2.3.3 鞭毛flaA基因編碼蛋白的親水性和疏水性分析 利用BioEdit和DNAStar分析:鞭毛flaA基因編碼蛋白最大疏水指數(shù)1.86,最小疏水指數(shù)-2.68;最大親水指數(shù)2.68,最小親水指數(shù)-1.86.其分析結(jié)果如圖4所示.
2.3.4 鞭毛flaA基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測
通過Gamier-Robso方法預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),鞭毛flaA基因編碼蛋白分子存在11處α螺旋、21處β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲則相對較少;而應用Chou-Fasman方法,發(fā)現(xiàn)有10處 α 螺旋、11處 β 折疊、β轉(zhuǎn)角則多至18處.
2.3.5 鞭毛flaA基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測
將推導的氨基酸序列利用Swiss-Model Workspace進行同源建模,以第2~303位氨基酸序列預測鞭毛flaA基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖5).
圖4 框鏡鯉AV CY0806 flaA蛋白的疏水性和親水性分析Fig.4 Hydrophilicity prediction and hydrophobicity prediction of Cyprinus carpio AV CY0806 flaA
圖5 flaA三維結(jié)構(gòu)預測Fig.5 3D structure prediction of flaA
維氏氣單胞菌作為一種較新型的人-獸-魚共患病原菌,在引發(fā)人的各種疾病的同時,近年來,已有相當多的報道,證明其可以感染多種水生動物并引發(fā)多種疾病的流行.本研究所用菌株即為框鏡鯉敗血癥病原菌[7],該菌株經(jīng)試驗證實,可以感染多種魚類并引起相應的病癥,但其發(fā)病機理尚不清楚.而鞭毛作為多種細菌的運動器官,在細菌感染、免疫等方面發(fā)揮重要作用,其主要化學組成為蛋白質(zhì),具有良好的免疫原性.目前,從基因水平研究病原菌的鞭毛,是研究病原菌致病的分子機制和研發(fā)基因工程疫苗的基礎[8-9].為此,本試驗對框鏡鯉源 AV鞭毛flaA基因進行了克隆并對其編碼蛋白進行了相關(guān)生物信息學的分析.
本研究從框鏡鯉AV CY0806株中克隆了flaA基因,經(jīng)PCR與測序分析,成功地獲得了長915 bp的flaA基因,其編碼304個氨基酸,與其他氣單胞菌屬的菌株進行相似性分析,發(fā)現(xiàn)菌株CY0806 flaA基因與 GenBank上的維氏氣單胞菌 EU410309、EU410323進化距離較近,進化樹在同一分支上.但也發(fā)現(xiàn),有部分基因存在差異,可能與菌株來源、地域差異有很大關(guān)系.
預測蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu),是了解蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)信息的重要途徑,其預測方法以同源建模、線串法和從頭建算法為主[10],其中,同源建模法是最為成功和準確的方法.本研究以同源建模法預測了flaA三維立體結(jié)構(gòu).預測結(jié)果,將有利于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行改造,使蛋白質(zhì)的相應特性更趨于理想;另一方面還可進行分子設計,使可能成為藥物的蛋白質(zhì)更好地與受體結(jié)合,充分發(fā)揮藥物的功效[11].
本試驗克隆了維氏氣單胞菌CY0806株的flaA基因,構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹,并對其編碼的蛋白進行了生物信息學分析,為以后研究維氏氣單胞菌的發(fā)病機制、診斷方法的建立及研發(fā)疫苗以預防由AV引起的疾病提供了理論依據(jù),為更好地研究這一新型人-獸-魚共患病原菌奠定了基礎.
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