王寶龍，蘭 婷，李明華，張俊娜,李穆瓊，李曉曄，王玉琨(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系化學(xué)教研室，西安 710032)

HPLC法測(cè)定血漿中左羥丙哌嗪及藥代動(dòng)力學(xué)研究

王寶龍，蘭 婷，李明華，張俊娜,李穆瓊，李曉曄，王玉琨(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系化學(xué)教研室，西安 710032)

目的：建立一種簡(jiǎn)單快速的高效液相色譜法測(cè)定左羥丙哌嗪在人血漿中的濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究方法。方法：以迪馬C18(250mm×4.6mm，5μm)為色譜柱，流動(dòng)相：乙腈∶水(1000ml水加入醋酸2.5ml、三乙胺5ml)=5∶95，流速：1.0m/ml，波長(zhǎng)：λex=240nm，λem=350nm，進(jìn)樣量：20 μl，柱溫：35℃。結(jié)果：20名健康受試者單次口服60mg左羥丙哌嗪片，其t1/2為(1.72±0.64)h，tmax為(0.95±0.24) h，Cmax為(385.68±100.98)ng/ml，AUC(0～12h)為(883.32±245.94)ng/h，AUC(0～∞)為 (939.17±279.51)ng/h。結(jié)論：服用該藥后，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，個(gè)體之間、不同年齡、體質(zhì)量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。

左羥丙哌嗪；高效液相色譜法；藥代動(dòng)力學(xué)

左羥丙哌嗪是一類具有手性的藥物。該藥通過對(duì)氣管、支氣管C-纖維外周選擇性抑制作用而發(fā)揮鎮(zhèn)咳作用[1]。其作用部位在神經(jīng)結(jié)后與感覺性神經(jīng)肽相關(guān)的位點(diǎn)。本品鎮(zhèn)咳作用強(qiáng)，維持時(shí)間長(zhǎng)。由于對(duì)腎上腺素受體、M膽堿受體和阿片受體均無明顯作用，因此其中樞抑制的不良反應(yīng)較少[2]?？诜罅u丙哌嗪吸收迅速，主要分布在支氣管肺部。本品在體內(nèi)被廣泛代謝。35%原型和代謝產(chǎn)物在口服48h內(nèi)從尿排出。主要用于由上呼吸道感染、咽炎、間質(zhì)性肺炎、支氣管哮喘和支氣管炎等呼吸疾病引起的干咳和持續(xù)性咳嗽。

迄今報(bào)道的測(cè)定左羥丙哌嗪的方法有HPLC-UV法[3-4]、流動(dòng)注射發(fā)光法[5-6]、RF-HPLC法[7-9]。本試驗(yàn)在以上熒光法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了條件優(yōu)化，旨在建立測(cè)定血漿中左羥丙哌嗪的方法，并對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1儀器

日本島津高效液相色譜儀(型號(hào)LC-20AT)，熒光檢測(cè)器(型號(hào)RF-10AXL)。

1.2試劑

左羥丙哌嗪分散片(生產(chǎn)廠家：昆明源瑞制藥有限公司，規(guī)格：60mg/片，批號(hào)：20091201)，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為pH基準(zhǔn)試劑。

2 方 法

2.1對(duì)照品溶液的配制

精密稱取左羥丙哌嗪5mg，置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容再續(xù)取左羥丙哌嗪1ml，置于10ml量瓶中，用甲醇定容得到10μg/ml的左羥丙哌嗪貯備液。

2.2受試者的選擇

隨機(jī)選擇男性健康受試者20名，年齡(35.3±3.0)歲，身高(169.8±2.9)cm，體質(zhì)量(61.8±2.9)kg。試驗(yàn)前經(jīng)病史詢問、體檢、胸透、心電圖、血及尿常規(guī)、血生化檢查，各項(xiàng)指標(biāo)均正常，受試者無藥物過敏史和藥物依賴史，無精神病史及其他慢性病史。受試前2周及試驗(yàn)期間未服用任何藥物，受試期間禁煙、酒及其他含咖啡因、茶堿等飲料，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。所有受試者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書，試驗(yàn)方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.3給藥方法

左羥丙哌嗪正常臨床治療劑量為一次口服60mg，3次/d。鑒于國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道多采用單劑量口服左羥丙哌嗪60mg，為便于與文獻(xiàn)比較，故本試驗(yàn)左羥丙哌嗪的給藥劑量確定為單次口服60mg。

2.4采集血樣

受試者禁食12h后，早晨空腹給藥，用溫開水250ml吞服藥物，服藥后4h進(jìn)統(tǒng)一食譜的標(biāo)準(zhǔn)餐?？诜幬锴俺槿】瞻籽獦?ml，在服藥后的10、20、30、45min，1、1.5、2、3、4、6、8h和12h分別采靜脈血5ml，置無菌肝素抗凝的試管中，離心分離出血漿置無菌試管中，于-20℃保存。

2.5血藥濃度測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：迪馬C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈∶水(1000ml加入醋酸2.5ml、三乙胺5ml)=5∶95，流速：1.0ml/ml，波長(zhǎng)：λex=240nm，λem=350nm，進(jìn)樣量：20μl，柱溫：35℃。

2.5.2 血漿樣品處理 取樣品血漿1ml置于10ml具塞玻璃離心管中，然后精密加入1mol/L的K2HPO4(pH=8.9) 1.0ml，混合后加入二氯甲烷-乙醚(7∶3) 7ml，渦旋混合3min，離心5min(3000rpm)。取上層有機(jī)層，用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.4ml蒸餾水溶解并進(jìn)樣。

2.6特異性考察

左羥丙哌嗪對(duì)照品、空白血漿、空白血漿加對(duì)照品、血漿樣品色譜圖見圖1，左羥丙哌嗪的保留時(shí)間大約為11.7min，分離度良好，可確保分析方法的專一性。

圖1 左羥丙哌嗪色譜圖

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取1ml空白血漿共9份，依次加入左羥丙哌嗪儲(chǔ)備液0、1、2、5、10、20、40、80μl和100μl制成0、10、20、50、100、200、400、800ng/ml和1000ng/ml的血漿樣品，按2.5.2項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，以藥物峰面積為縱坐標(biāo)(y)，血藥質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)作回歸分析，得回歸方程：y= 4044.519x+ 85623.377 (r=0.9989)。結(jié)果表明，在10～1000ng/ml線性范圍內(nèi)，左羥丙哌嗪線性關(guān)系良好，按該方法測(cè)得的左羥丙哌嗪的血藥質(zhì)量濃度的檢測(cè)限為2ng/ml，最低定量限為10ng/ml。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取離心管數(shù)支，精密加入1ml空白血漿，再分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪溶液，渦旋混勻，配成質(zhì)量濃度為20、200ng/ml和800ng/ml的左羥丙哌嗪血漿若干份，取上述質(zhì)量濃度樣品，分別考察室溫和-80℃冰凍保存30d及反復(fù)凍融之后的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，經(jīng)過室溫放置，-80℃冰凍保存30d及反復(fù)凍融之后，左羥丙哌嗪的濃度基本無變化，RSD值均小于4.2%。

2.9精密度實(shí)驗(yàn)

離心管數(shù)支，于離心管中分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪標(biāo)準(zhǔn)液適量，渦旋混勻，配成20、200ng/ml和800ng/ml的左羥丙哌嗪標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度做5份樣品，每次做一批并隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按2.5.2項(xiàng)下操作；連續(xù)分析三批，記錄左羥丙哌嗪峰面積(y)，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得實(shí)測(cè)濃度，測(cè)得三個(gè)質(zhì)量濃度的批內(nèi)精密度RSD值分別為4.73%、3.28%、1.46%，批間精密度RSD值分別為4.98%、3.10%、4.26%，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的分析方法精密度良好。

2.10提取率實(shí)驗(yàn)

取離心管數(shù)支，于離心管中分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪對(duì)照液，精密加入1ml流動(dòng)相，渦旋混勻，配成含左羥丙哌嗪質(zhì)量濃度分別為20、200ng/ml和800ng/ml的溶液，按2.5.2項(xiàng)下操作，每種濃度做5份樣品，記錄左羥丙哌嗪峰面積(ys)。

取離心管數(shù)支，于離心管中分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪標(biāo)準(zhǔn)液適量，精密加入1ml空白血漿，渦旋均勻，配成20、200、800ng/ml的左羥丙哌嗪血漿樣品，按2.5.2項(xiàng)下操作，每種濃度做5份樣品。記錄色譜圖，記錄峰面積yi，yi和ys之比即為左羥丙哌嗪的提取率。結(jié)果表明，本分析方法的平均提取率大于85%，能作為實(shí)驗(yàn)用的提取方法。

3 結(jié) 果

圖2 健康受試者口服左羥丙哌嗪后的平均血藥濃度時(shí)間曲線圖

3.1血藥濃度測(cè)試結(jié)果

受試者血漿樣品按2.5.2項(xiàng)下操作，每批樣品測(cè)定之前均隨行標(biāo)曲，并在測(cè)定時(shí)隨機(jī)分配含左羥丙哌嗪質(zhì)量濃度為20、200ng/ml和800ng/ml的質(zhì)控樣品，計(jì)算樣品和質(zhì)控樣品的濃度，根據(jù)質(zhì)控樣品的測(cè)定結(jié)果決定當(dāng)日數(shù)據(jù)的取舍，受試者的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

3.2藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

將受試者的經(jīng)時(shí)血藥濃度錄入DAS(ver2.0.1)程序計(jì)算。20名健康受試者口服左羥丙哌嗪后，其消除半衰期t1/2為 (1.72±0.64)h，tmax為(0.95±0.24) h，Cmax為 (385.68±100.98)ng/ml，AUC(0～12h)為 (883.32±245.94)ng/h，AUC(0～∞)為 (939.17±279.51)ng/h。

4 討 論

我們考察了不同流動(dòng)相對(duì)左羥丙哌嗪出峰時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖液濃度的微小變化對(duì)樣品出峰時(shí)間影響較大，經(jīng)過多次平行實(shí)驗(yàn)，最終確定用文中所述的流動(dòng)相組成，這樣既保證了樣品能在12min之前出峰，縮短測(cè)試時(shí)間，又盡可能的減少有機(jī)相的用量，減少對(duì)環(huán)境的污染。

在處理血漿方面，之前有文獻(xiàn)報(bào)道用三氯甲烷∶異丙醇=9∶1[7-8]，三氯甲烷[9]作為萃取液提取血漿中的左羥丙哌嗪，但以上方法均要用到毒性較大的三氯甲烷，而我們采用了毒性較小的二氯甲烷，又加入一定量的乙醚作為萃取液，該萃取液體系對(duì)左羥丙哌嗪的提取效果好，提取率高，且在萃取時(shí)處在血漿的上方，使得進(jìn)行實(shí)驗(yàn)更加方便且污染較小。

在選擇檢測(cè)方法方面，我們先選取了紫外法測(cè)定左羥丙哌嗪的濃度，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在其最大吸收波長(zhǎng)240nm處其吸收比較弱，用此方法檢測(cè)的靈敏度低，造成的測(cè)量誤差大。最后經(jīng)過篩選，決定用熒光法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，減少了血漿中雜質(zhì)的干擾，從而提高了左羥丙哌嗪檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)建立了RF-HPLC法測(cè)定左羥丙哌嗪片劑的方法，并測(cè)試了該藥的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法分離度高，選擇性好，樣品在-80℃冰凍保存條件下可放置30d，提取回收率大于85%，方法成熟、完善，均有較高的專屬性，可用于左羥丙哌嗪的臨床研究工作。

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[編輯] 一 凡

R914

A

1673-1409(2012)04-R058-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.030

2012-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21172261，21042008)。

王寶龍(1984-)，男，陜西西安人，助教，主要從事藥物合成與分析研究；通訊作者：王玉琨，E-mail：wangyk@fmmu.edu.cn。