龐濤濤 (山西師范大學分析測試中心， 山西 臨汾 041004)

張緒言 (山西華潤煤業(yè)有限公司，山西 太原 030001)

苦丁茶紫外圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法

龐濤濤 (山西師范大學分析測試中心， 山西 臨汾 041004)

張緒言 (山西華潤煤業(yè)有限公司，山西 太原 030001)

用3種溶劑氯仿、無水乙醇及水，系統(tǒng)提取苦丁茶等不同極性區(qū)間成分，測定其紫外圖譜，研究樣品的異同，采用圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法分析苦丁茶紫外圖譜。結(jié)果表明：該方法可以準確地區(qū)分不同產(chǎn)地和不同級別的苦丁茶。利用共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法可以對2個或多個樣品進行方便可靠的鑒別，是一種符合中藥自身特點的光譜指紋圖譜分析方法。

苦丁茶；雙指標法；共有峰率；變異峰率；序列分析

苦丁茶系冬青科植物大葉冬青(llexlatifoliaThunb)的干燥葉，是我國南部和西南部民間常用的藥用植物,具有散風熱、清頭目、除煩渴、止頭疼等功效?？喽〔柙谖覈植驾^廣，不同的產(chǎn)地其品質(zhì)各異。因此建立一種快速、準確的鑒別苦丁茶的方法，對苦丁茶的質(zhì)量監(jiān)控具有十分重要的意義。

各種現(xiàn)代儀器已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究中，其中光譜分析由于其操作簡便，穩(wěn)定性好，測試速度快和測試成本低而被廣泛應(yīng)用。紫外圖譜分析采用間隔一定波長取測量數(shù)據(jù)，建立大的數(shù)據(jù)集，進行數(shù)理統(tǒng)計分析[1-3]，可以對多個樣本進行準確的分類，考慮到生物樣品各類成分之間的非對稱性關(guān)系,根據(jù)藥材自身具有遺傳穩(wěn)定性和變異性的生物學特點,建立了共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法。用該法可以對不同中藥樣品做出定量且細致的區(qū)別,可以對至少2個樣品進行定量鑒別。研究發(fā)現(xiàn),與紅外指紋圖譜[4-8]、HPLC 指紋圖譜[9]比較,中藥紫外指紋圖譜有著最好的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

本研究采用3種溶劑系統(tǒng)提取中藥不同極性區(qū)間的成分，分別測定它們的指紋圖譜，可以給出十幾個特征吸收峰數(shù)據(jù)。借助于紫外光譜[10]用共有峰率和變異峰率雙指標序列法研究了不同產(chǎn)地、不同級別苦丁茶的紫外圖譜，結(jié)果表明該方法可以較好地鑒別不同產(chǎn)地及不同級別的苦丁茶。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器和試劑

UV-2201型紫外-可見分光光度計(日本島津)、KH-250B型超聲波清洗器、無水乙醇(分析純)、氯仿(分析純)、二次蒸餾水。測試樣品來源于浙江、海南(二級，一級，特級)、四川(特級，一級，特級)、云南、廣西(一級，特級)、廣東6個產(chǎn)地共11種苦丁茶，編號依次為K1～K11。

1.2 測試樣品制備及測試條件

樣品加入各種提取溶劑，分別在室溫下采用超聲方法提取45min可達到最大且穩(wěn)定的提取率。測定波長200～600nm，狹縫2.0nm，采樣間隔0.2nm。

1.3 紫外指紋圖譜測試液制備

將藥材粉末過100目篩,精密稱取0.250g，置于具塞50ml錐形瓶中，精密加入20ml氯仿，超聲提取45min，過濾，用氯仿洗滌，收集洗滌液，定容至25ml，作為待測液，揮干樣品所帶氯仿，加入20ml無水乙醇，超聲提取45min，過濾、洗滌得25ml無水乙醇提取液，水提取液方法同。氯仿測定原液或稀釋1～2倍，無水乙醇提取液稀釋5倍，水提取液稀釋10倍(使最大光密度Dlt;2或接近2)，以對應(yīng)的溶劑為參比溶液進行紫外圖譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外指紋圖譜共有峰的確定

表1 苦丁茶氯仿、無水乙醇和水提取液紫外指紋圖譜共有吸收峰波長 nm

對于紫外光譜圖譜，可采用中藥指紋圖譜共有峰的理論識別方法W正態(tài)分布檢驗判別法，對各種共有峰進行識別。而對于一組非常接近的吸收峰，它們相差很小，但不滿足正態(tài)分布，可采用如下方法確定共有峰：對于一組吸收峰，若組內(nèi)吸收峰波長的最大差異顯著小于該組與相鄰組之間的平均波數(shù)差，就確定該組峰是一組共有峰。結(jié)果見表1。

2.2苦丁茶紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列

共性鑒別指標：(1)共有峰率P=(共有峰數(shù)Ng/2個UV圖中的獨立峰數(shù)Nd)·100%。(2)共有峰數(shù)Ng：指在比較的2個UV圖中都出現(xiàn)的吸收峰的個數(shù)。(3)獨立峰：紫外圖譜中不同的吸收峰。na：圖譜a中相對與其共有峰的非共有峰數(shù)，稱為a的變異峰數(shù)。nb：圖譜中b相對與其共有峰的非共有峰數(shù)，稱為b的變異峰數(shù)。(4)獨立峰數(shù)Nd：相互比較的2個UV圖中的獨立峰總數(shù)Nd=Ng+na+nb。

變異鑒別指標：變異峰率Pv：一個圖譜的變異峰率Pv是該UV圖中相對于共有峰的變異峰數(shù)與其共有峰數(shù)的比值Pva= (na/Ng)·100%。Pva：圖譜a的變異峰率；Pvb= (nb/Ng)·100%。Pvb：圖譜b的變異峰率。

11個苦丁茶樣品的雙指標序列如下：

K1:K9K10(60.00;50.0,16.7) K4(54.5;50.0,33.3) K8K11(50.00;80.0,20.0) K2K3(45.5;80.0,40.0) K5K7(35.7;80.0,100.0) K6(26.7;125.0,150.0)

K2:K4(87.5;0,14.3) K3(75.0;16.7,16.7) K1(45.5;40.0,80.0) K8(44.4;75.0,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K10(40.0;75.0,75.0) K6(30.8;75.0,150.0) K9(27.3;133.3,133.3) K11(25.0;200.0,100.0)

K3:K4(87.5;0,14.3) K2(75.0;16.7,16.7) K1(45.5;40.0,80.0) K8(44.4;75.0,50.0) K5K6K7(41.7;40.0,100.0) K10(40.0;75.0,75.0) K11(30.0;133.3,100.0) K9(27.3;133.3,133.3)

K4:K2K3(87.5;14.3,0) K8(55.6;60.0,20.0) K1(54.5;33.3,50.0) K5K7(50.0;33.3,66.7) K11(40.0;100.0,50.0) K6(38.5;60.0,100.0) K9K10(36.4;100.0,75.0)

K5:K6K7(81.8;11.1,11.1) K4(50.0;66.7,33.3) K8K11(45.5;100.0,20.0) K2K3K9K10(41.7;100.0,40.0) K1(35.7;100.0,80.0)

K6:K5K7(81.8;11.1,11.1) K3(41.7;100.0,40.0) K4(38.5;100.0,60.0) K8K11(33.3;150.0,50.0) K2K9K10(30.8;150.0,75.0) K1(26.7;150.0,125.0)

K7:K5K6(81.8;11.1,11.1) K4(50.0;66.7,33.3) K8K11(45.5;100.0,20.0) K2K3K9K10(41.7;100.0,40.0) K1(35.7;100.0,80.0)

K8:K11(71.4;20.0,20.0) K9K11(62.5;20.0,40.0) K4(55.6;20.0,60.0) K1(50.0;20.0,80.0) K5K7(45.5;20.0,100.0) K2K3(44.4;50.0,75.0) K6(33.3;50.0,150.0)

K9:K10(85.7;16.7,0) K11(75.0;16.7,16.7) K8(62.5;40.0,20.0) K1(60.0;16.7,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K4(36.4;75.0,100.0) K6(30.8;75.0,150.0) K2K3(27.3;133.3,133.3)

K10:K9(85.7;16.7,0) K11(75.0;16.7,16.7) K8(62.5;40.0,20.0) K1(60.0;16.7,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K2K3(40.0;75.0,75.0) K4(36.4;75.0,100.0) K6(30.8;75.0,150.0)

K11:K9K10(75.0;16.7,16.7) K8(71.4;20.0,20.0) K1(50.0;20.0,80.0) K5K7(45.5;20.0,100.0) K4(40.0;50.0,100.0) K6(33.3;50.0,150.0) K3(30.0;100.0,133.3) K2(25.0;100.0,20.0)

*K9:K10(85.7;16.7,0)表示該序列以K9為標準計算其他樣品圖譜的共有峰率和變異峰率，該序列片斷表示K9和K10的共有峰率是85.7，其中K9的變異峰率為16.7，K10的變異峰率為0，K7:K5K6(81.8;11.1,11.1)表示K5K6與K7的共有峰率相等，為81.8，K5K6與K7具有相同的變異峰率11.1。

由上述序列可知，在不同的序列中，不同樣品的共有峰率不同，樣品之間的關(guān)系一般不同。利用該n維雙指標序列空間可以方便地找到某一樣品的最相近樣品，從而可以避免在單一序列空間中比較不同樣品。從上述序列看，該分析方法得到的結(jié)論可靠。

因此，利用n個樣品為標準建立n維共有峰率和變異峰率序列空間，可以更合理地建立不同樣品之間最直接的相似性聯(lián)系，得到更合理的鑒別結(jié)論。與某一樣品具有相同共有峰率的樣品，往往具有不同的變異峰率，或者與某一樣品具有相同變異峰率的樣品，往往具有不同的共有峰率，因而雙指標指紋圖譜分析方法較單指標分析法具有更高的分辨率，利用雙指標分析法可以對樣品進行更深層次的區(qū)分及認同。如：K2:K8(44.4;75.0,50.0) K10(40.0;75.0,75.0) K6(30.8;75.0,150.0)中K2與K8K10K6具有相同的變異峰率，但K2和K8、K10與K6的共有峰率不同，分別是44.4、40.0與30.8，可以更好地做出區(qū)分。K3:K5K6K7(41.7;40.0,100.0)中K5K6K7與K3具有相同的共有峰率及變異峰率，說明K5K6K7三者相對于K3，它們確實非常相似。

2.3 11種苦丁茶的基本關(guān)系組、對及分析

A:K2:K4(87.5;0,14.3) K3(75.0;16.7,16.7),K3:K4(87.5;0,14.3) K2(75.0;16.7,16.7),K4:K2K3(87.5;14.3,0)

在A組中上述實驗結(jié)果表明：K2、K3、K4海南3種苦丁茶關(guān)系最近，且相似程度最高。

B:K1:K8K11(50.00;80.0,20.0),K5:K8K11(45.5;100.0,20.0),K6:K8K11(33.3;150.0,50.0),K7:K8K11(45.5;100.0,20.0)

在B組中，上述實驗結(jié)果表明：相對于浙江和四川苦丁茶而言，云南和廣東苦丁茶共有峰率一樣，即在不同產(chǎn)地的苦丁茶中，云南和廣東苦丁茶相似程度最大。

C:K2:K10(40.0;75.0,75.0) K9(27.3;133.3,133.3) K3:K10(40.0;75.0,75.0) K9(27.3;133.3,133.3)

K11:K4(40.0;50.0,100.0) K3(30.0;100.0,133.3) K2(25.0;100.0,20.0)

相對于海南一級和二級苦丁茶而言，廣西兩種級別苦丁茶共有峰率大小順序為：K10gt;K9，即：特級gt;一級。相對于廣東苦丁茶而言，海南3種級別苦丁茶共有峰率大小順序為K4gt;K3gt;K2，即：特級gt;一級gt;二級。由11種苦丁茶的雙指標序列可以看出：對于同一產(chǎn)地的苦丁茶來說，相對于任何一種苦丁茶來說，K5K7gt;K6，即：四川特級gt;四川一級。因此，利用共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法，可以對上述11種苦丁茶給出符合實際情況的鑒別結(jié)論。

從變異峰率看，不同產(chǎn)地的苦丁茶之間的變異峰率最大，如：K1:K6(26.7;125.0,150.0)。同一產(chǎn)地不同級別的苦丁茶之間的變異峰率較小，如：K2:K3(75.0;16.7,16.7)。而同一產(chǎn)地級別相同的苦丁茶之間的變異峰率最小，如：K2:K4(87.5;0,14.3)，這正確的反映了實際情況。

上述分析表明，不同產(chǎn)地，同一產(chǎn)地不同級別及同一級別之間均存在著明顯的差異。從多維共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法可以得到更多的信息，對不同產(chǎn)地、不同級別具有準確、精細且非常直觀的鑒別能力。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，氯仿、無水乙醇和水3種溶劑紫外圖譜吸收峰的共性和差異可以用多維共有峰率和變異峰率序列以數(shù)量精確地表示出來，因而三溶劑紫外圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法是一種新的精確鑒別中藥的方法。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.01.010

O657.32

A

1673-1409(2012)01-S035-03

2011-12-10

龐濤濤(1980-),女,山西文水人,博士生,研究方向為藥物分析。