范昕 侯雯躋 王旭青 盧曠逸 馬小艷 張建新

·短篇論著·

小鼠胰腺星狀細(xì)胞TLR-9的表達(dá)及意義

范昕 侯雯躋 王旭青 盧曠逸 馬小艷 張建新

近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰腺纖維化及胰腺癌耐藥與胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)有關(guān)，具體機制尚不清楚[1-3]。有文獻(xiàn)報道，肝星狀細(xì)胞表達(dá)TLR-9，并通過TLR-9介導(dǎo)肝纖維化[4]。PSCs與肝星狀細(xì)胞相似，但其是否表達(dá)TLR-9尚不知曉。本研究旨在了解PSCs的TLR-9表達(dá)，探討TLR-9對PSCs功能的影響。

一、材料與方法

1．小鼠PSCs分離培養(yǎng)：清潔級昆明小鼠，體重20 g左右，雌雄不限，由江蘇大學(xué)動物實驗中心提供。參考Bachem等[5]及李波靜等[6]大鼠PSCs分離方法，并加以改進(jìn)。主要操作步驟：取昆明種小鼠，消毒3 min后剖腹，迅速切除胰腺,放入盛有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，剔除胰腺被膜及血管組織，將其剪至約1 mm×1 mm×1 mm大小，然后將組織塊均勻涂抹在預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶瓶底，于5% CO2的培養(yǎng)箱靜置30 min，待組織塊貼壁后用預(yù)熱的PBS輕輕沖洗一次，加入含有20%胎牛血清(Gibco公司)及胰酶抑制劑的DMEM培養(yǎng)液5 ml，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，第一天換液，以后隔天換液，約1周左右PSCs鋪滿瓶底60%～70%時傳代。

2．TLR-9蛋白表達(dá)的檢測：小鼠胰腺組織TLR-9表達(dá)采用免疫組化方法檢測，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。PSCs的TLR-9表達(dá)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測。兔抗鼠TLR-9抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自SANTA CRUZ公司，工作濃度1∶200。

3．細(xì)胞增殖檢測：采用MTT法。將PSCs均勻接種至96孔板，每孔104個細(xì)胞，分為對照組、激動劑ODN1826(終濃度2.5 μg/ml，Invivogen公司)組、激動劑ODN1826+拮抗劑ODN2088(終濃度5 μg/ml，Invivogen公司)組，每組設(shè)5個復(fù)孔。隔天換液，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，每孔加入 20 μl 5% MTT(Sigma公司)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，上酶標(biāo)儀測各孔A490值。

4．一氧化氮(NO)檢測：將PSCs均勻接種至6孔板，每孔105個細(xì)胞，同上述分為對照組、ODN1826組、ODN1826+ODN2088組，培養(yǎng)72 h。收集上清，采用NO試劑盒(南京建成公司)檢測NO水平，按照試劑盒說明書操作。

5．統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計。

二、結(jié)果

1．PScs的狀態(tài)特征：組織塊植入后24 h,PSCs從胰腺間質(zhì)中爬出,呈三角形或星形，同時胞質(zhì)內(nèi)可見脂肪滴。隨著培養(yǎng)時間的推移，脂滴逐漸消失，傳代后，體積變大，突起豐富,呈典型的“稻草把樣”(圖1)。

2．小鼠胰腺組織及PSCs的TLR-9表達(dá)：小鼠胰腺組織及PSCs均表達(dá)TLR-9(圖2)。

圖1 小鼠PSCs培養(yǎng)第3天(a)和傳代后2 d(b)的形態(tài)(×100)

圖2 小鼠PSCs的TLR-9表達(dá)(a免疫組化，×400；b蛋白質(zhì)印跡法)

3．PSCs增殖的變化：對照組小鼠PSCs培養(yǎng)1～5 d的A490值分別為0.133±0.002、0.336±0.01、0.472±0.008、0.610±0.02、0.638±0.02；ODN1826組分別為0.130±0.002、0.268±0.004、0.397±0.01、0.429±0.01、0.497±0.02，自第2天起較同時間點親本細(xì)胞增殖顯著降低(F值分別為0.754、7.250、12.494、22.061、12.833，P值分別為0.510、0.025、0.003、0.000、0.002)；ODN1826+ODN2088組細(xì)胞增殖分別為0.131±0.001、0.318±0.01、0.44±0.006、0.593±0.02、0.613±0.01，與同時間點親本細(xì)胞增殖無顯著差異(P值分別為0.476、0.368、0.060、0.590、0.470，圖3)。

圖3 各組小鼠PSCs的生長曲線

4．PSCs的NO合成量變化：對照組、ODN1826組、ODN1826+ODN2088組細(xì)胞的NO合成量分別為(30.28±0.21)、(22.87±0.65)、(29.41±0.65)μmol/L，ODN1826組較親本細(xì)胞顯著減少(F=148，P=0.000)，而ODN1826+ODN2088組與親本細(xì)胞無顯著差異(P=0.114)。

討論正常胰腺組織中PSCs占4%，位于小葉間和腺泡周圍，呈靜止?fàn)顟B(tài)[7]。在胰腺慢性炎癥及胰腺惡性腫瘤中PSCs可被激活，活化的PSCs增殖能力及遷移能力較前均明顯提高[8]。大量研究表明，胰腺纖維化與PSCs密切相關(guān)。通過多種細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)如TGF-β1、PDGF等的參與，不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如磷脂酞肌醇3激酶(IP3)途徑和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而激活PSCs，并最終形成纖維化[9]。

胰腺癌的病理特征之一是進(jìn)行性纖維化及腫瘤粘連形成，這與細(xì)胞外基質(zhì)中PSCs的增殖關(guān)系密切[10-11]。在體外，胰腺癌細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞耐藥；PSCs也可以被胰腺腫瘤細(xì)胞激活[11-12]。這些都提示PSCs與胰腺癌的發(fā)展有協(xié)同關(guān)系，PSCs支持腫瘤細(xì)胞生長、侵襲及耐藥，同時腫瘤細(xì)胞激活PSCs。兩者協(xié)同作用，通過正反饋機制導(dǎo)致胰腺癌的高度惡性的生物學(xué)特征。

目前認(rèn)為，胰腺纖維化及胰腺癌耐藥的形成是一個以胰腺星狀細(xì)胞活化為核心的復(fù)雜的病理過程[11]。因此對PSCs生物學(xué)特性的深入研究意義深遠(yuǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，PSCs細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體[13]，如TLR-2、TLR-4，但未見胰腺星狀細(xì)胞表達(dá)TLR-9的報道。在本研究中，通過免疫組化及蛋白質(zhì)印跡法證實了PSCs表達(dá)TLR-9。體外實驗表明，PSCs分泌的NO可刺激胰腺腫瘤細(xì)胞分泌胰腺癌耐藥相關(guān)因子IL-1β[14]。本研究將分離培養(yǎng)的PSCs分別加入TLR-9的激動劑及拮抗劑，結(jié)果顯示TLR-9激動劑可明顯減弱PSCs的增殖能力，并有效減少NO的合成。加入抑制劑后上述效應(yīng)被抑制，表明PSCs有TLR-9受體存在，激活PSCs的TLR-9受體，能減少PSCs對NO的分泌并抑制PSCs的增殖。

通過激活PSCs的TLR-9受體改變其生物學(xué)特性。這對于研究胰腺纖維化有重要意義。目前，TLR-9減少PSCs對NO

的分泌并抑制PSCs的增殖的機制尚不清楚。我們正在進(jìn)行相關(guān)實驗，試圖了解其過程中關(guān)鍵的細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)以及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

[1] Strimpakos AS, Syrigos KN, Saif MW. Translational research in pancreatic cancer.JOP,2010,11:124:127.

[2] Scarlett CJ, Colvin EK, Pinese M, et al. Recruitment and Activation of Pancreatic Stellate Cells from the Bone Marrow in Pancreatic Cancer: A Model of Tumor-Host Interaction. PLoS One,2011,6:e26088.

[3] Saito R,Yamada S,Yamamoto Y, et al.Conophylline suppresses pancreatic stellate cells and improves islet fibrosis in Goto-Kakizaki rats.Endocrinology,2012,153: 621-630.

[4] Watanabe A, Hashmi A, Gomes DA. Apoptotic hepatocyte DNA inhibits hepatic stellate cell chemotaxis via toll-like receptor 9. Hepatology,2007,46: 1509-1518.

[5] Bachem MG, Schneider E,Gross H,et al. Identification, culture, andcharacterization of pancreatic stellate cells in rats and humans. Gastroenterology,1998,115: 421-432.

[6] 李波靜,王興鵬,吳愷.肥大細(xì)胞在大鼠胰腺組織纖維化形成中的作用及其機制.中華消化雜志,2006,26:171-175.

[7] Liotta LA, Kohn EC. The microenvironment of the tumour-host interface. Nature, 2001,411:375-379.

[8] Bachem MG, Zhou S, Buck K,et al. Pancreatic stellate cells-role in pancreas cancer. Langenbecks Arch Surg,2008,393:891-900.

[9] 胥明，王興鵬.胰腺星狀細(xì)胞的生物學(xué)特性. 胰腺病學(xué),2005,5:54-55.

[10] Mantoni TS, Lunardi S, Al-Assar O, et al.Pancreatic stellate cells radioprotect pancreatic cancer cells through β1-integrin signaling. Cancer Res,2011,71:3453-3458.

[11] Dunér S, Lopatko Lindman J,Ansari D,et al. Pancreatic cancer: the role of pancreatic stellate cells in tumor progression.Pancreatology, 2010,10:673-681.

[12] Fujita H, Ohuchida K, Mizumoto K,et al.Tumor-stromal interactions with direct cell contacts enhance proliferation of human pancreatic carcinoma cells. Cancer Sci,2009,100:2309-2317.

[13] Masamune A,Kikuta K,Watanabe T, et al. Pancreatic stellate cells express Toll-like receptors.J Gastroenterol,2008,43:352-362.

[14] Müerkoster S，Wegehenkel K，Arlt A，et al．Tumor stroma interactions induce chemoresistance in pancreatic ductal carcinomacells involving increased secretion and paracrine effects of nitricoxide and interleukin-1beta.Cancer Res,2004,64:1331-1337.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.021

國家自然科學(xué)基金(81070287)；鎮(zhèn)江市2009年度科技計劃(科技支撐-社會發(fā)展)(SH2009013)；江蘇大學(xué)臨床發(fā)展基金(JLY2010127)

212001 鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科(范昕、王旭青、張建新)；江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(侯雯躋、盧曠逸、馬小艷)

張建新，Email:zhangjx1818@163.com

2012-02-07)

(本文編輯：呂芳萍)