趙永福 楊紅星 唐哲

胰腺癌XAF1基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)的相關(guān)性

趙永福 楊紅星 唐哲

XIAP相關(guān)因子1(XIAP-associated factor 1,XAF1)是一個新發(fā)現(xiàn)可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，可以逆轉(zhuǎn)XIAP對細(xì)胞的保護(hù)作用。它在所有胚胎組織及成人正常組織中廣泛表達(dá)，但在許多腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株中低表達(dá)甚至不表達(dá)，是一種潛在的腫瘤抑制因子[1-3]。XAF1位點(diǎn)的雜合性缺失及XAF1啟動子區(qū)的CpG島甲基化可能是其表達(dá)被抑制的機(jī)制[4-6]。本研究檢測XAF1蛋白在胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中的表達(dá)及XAF1甲基化狀態(tài)，分析它們之間的相關(guān)性，探討其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

一、材料和方法

1．臨床資料：收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年1月至2011年1月間48例臨床資料齊備的手術(shù)切除的胰腺癌標(biāo)本、26例胰腺良性病變標(biāo)本(胰島素瘤20例，慢性胰腺炎6例)和15例正常胰腺標(biāo)本(外傷切除胰腺6例，十二指腸腫物切除獲得的正常胰腺9例)，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。胰腺癌患者中男36例，女12例，年齡37～75歲，其中≤55歲者13例，>55歲者35例，中位年齡61歲，術(shù)前均未給予放療、化療；胰腺良性疾病患者中男 9例，女 17例；正常胰腺組中男9例，女6例。

2．XAF1基因啟動子甲基化狀態(tài)檢測：采用生工生物工程(上海)有限公司的UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取組織DNA；采用EZ DNA Methylation-GoldTMKit(ZYMO公司)對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾；采用GENMED基因甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒(GENMED公司)進(jìn)行擴(kuò)增。XAF1引物參考文獻(xiàn)[7-8]，甲基化引物上游為5′-TTTGTAAGAAACGAAATTTAATCGA-3′，下游為5′-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3′，擴(kuò)增片段228 bp。未甲基化引物上游為5′-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3′；下游為5′-CTCCTACCCTTAAAACCCACAAT-3′，擴(kuò)增片段230 bp。甲基化循環(huán)參數(shù)：95℃ 9 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)，72℃ 5 min。未甲基化循環(huán)參數(shù)：94℃ 9 min，94℃ 30 s、54℃ 45 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)，72℃ 5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳分離，紫外燈下觀察并攝像。

3．XAF1蛋白檢測：采用免疫組化法。兔抗人XAF1多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司，SP9001試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。結(jié)果判斷：XAF1 蛋白主要位于胞核和胞質(zhì),亦表達(dá)于核膜，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。每例觀察5個高倍視野，根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色程度及陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評分。無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞<20%為1分，20%～75%為2分， >75%為3分；無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃或棕褐色為3分。兩分相乘，0～3分為陰性，4～9分為陽性。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組蛋白表達(dá)陽性率采用Fisher精確檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用配對四格表的關(guān)聯(lián)性分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1．胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中的XAF1基因啟動子甲基化狀態(tài)：在胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因甲基化率分別為31.3%(15/48)、7.7%(2/26)和0(0/15),胰腺癌組織XAF1甲基化頻率較胰腺良性疾病及正常胰腺組織顯著增高 (χ2=5.289,P=0.021；χ2=6.152，P=0.013)，后兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.213，P=0.27，圖1)。

M：DNA Marker；1：陰性對照；2、3：胰腺癌組織；4、5：正常胰腺組織；m：甲基化引物；u：未甲基化引物

圖1胰腺癌和正常胰腺組織中XAF1基因啟動子甲基化狀態(tài)

2．胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1蛋白的表達(dá)：胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1蛋白表達(dá)陽性率分別為52.1%(25/48)、84.6%(22/26)、88.9%(16/18)，癌組織XAF1表達(dá)率顯著低于胰腺良性疾病及正常胰腺組織(χ2值為25.98、23.57，P值均<0.05，圖2)，而后兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)。胰腺癌組織XAF1蛋白表達(dá)與XFA1基因甲基化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.463，P<0.05)。

圖2胰腺癌(a)和正常胰腺組織(b)的XAF1表達(dá) (免疫組化 ×200 )

3．胰腺癌中XAF1基因啟動子甲基化及蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系： XAF1基因啟動子甲基化及其蛋白的表達(dá)與臨床分期、腫瘤組織病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P值均<0.05)，與患者性別、年齡及腫瘤大小、腫瘤部位均無關(guān)(P值均>0.05，表1)。

表1胰腺癌中XAF1基因啟動子甲基化及蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理特征例數(shù)XAF1基因甲基化(例)χ2值P值XAF1表達(dá)陽性(例)χ2值P值性別 男3692.6180.106180.2500.617 女1267年齡(歲) ≤551350.4320.51180.0100.920 >55351017腫瘤部位 胰頭3592.1830.140170.6390.424 胰體尾1368腫瘤大小 ≤33382.4140.120151.8590.173(cm) >315710淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有191320.2250.00065.2980.021 無29219分化程度 高1314.6050.032104.40850.036 中低351415臨床分期 Ⅰ～Ⅱ25213.1270.000188.2930.004 Ⅲ～Ⅳ23137

討論DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，將CpG二核苷酸中5′端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?′甲基胞嘧啶的過程，即在胞嘧啶的5′碳位共價結(jié)合了一個甲基(-CH3)。大量的研究表明，抑癌基因的沉默與其甲基化狀態(tài)相關(guān)[9-10]。

XAF1基因位于人類染色體17p13.2位點(diǎn),有8個外顯子，由301個氨基酸組成，分子質(zhì)量為33 1000，含有7個鋅指結(jié)構(gòu)。XAF1蛋白定位于胞質(zhì)和胞核內(nèi)。 XAF1過表達(dá)可使細(xì)胞停滯于G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長[5]。研究表明，多種腫瘤細(xì)胞株及腫瘤組織XAF1 mRNA低表達(dá)，如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌和小細(xì)胞肺癌等[10-12]。XAF1 mRNA低表達(dá)與XAF1基因啟動子區(qū)異常高甲基化有關(guān)，且與腫瘤的分期、分級有關(guān)[13-15]。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織XAF1基因的甲基化發(fā)生率高于胰腺良性疾病及正常胰腺組織；XAF1蛋白表達(dá)陽性率顯著低于胰腺良性疾病及正常胰腺組織，證實(shí)XAF1低表達(dá)與其啟動子的高甲基化呈負(fù)相關(guān)。本研究還顯示，胰腺癌組織XAF1蛋白的表達(dá)與臨床分期、腫瘤分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示XAF1反映胰腺癌的惡性程度及預(yù)后，有望成為判斷惡性程度及預(yù)后的的生物學(xué)指標(biāo)之一，并有可能為指導(dǎo)胰腺癌的藥物治療提供一個新的思路和靶點(diǎn)。

[1] Fong WG, Liston P, Rajcan-Separovic E, et al. Expression and genetic analysis of XIAP associated factor 1 ( XAF1) in cancer cell lines. Genomics,2000,70:113-122.

[2] li T，Chen CL，Wang JD，et al．Expression of heat-shock transcription factor 1 and X-linked inhibitor of apoptosis protein-associated factor-1 in gastrointestinal cancer．Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2008，28：487-490．

[3] Arora V, Cheung HH, Plenchette S, et al. Degradation of survivin by the X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) XAF1 complex. J Biol Chem, 2007, 282: 26202-26209.

[4] Xing Z, Zhou Z, Yu R, et al. XAF1 expression and regulatory effects of somatostatin on XAF1 in prostate cancer cells. J Exp Cin Cancer Res,2010,29:162.

[5] Wang J,Gu Q,Li M,et al.Identification of XAF1 as a novel cell cycle regulator though modulating G2/M checkpoint and interaction with checkpoint kinase 1 in gastrointestinal cancer.Carcinogenesis,2009,30:1507-1516.

[6] Lee MG, Huh JS, Chung SK, et al. Promoter CpG hypermethylation and downregulation of XAF1 expression in human urogenital malignancies: implicati on for attenuated p53 response to apoptotic stresses. Oncogene, 2006, 25:5807-5822.

[7] Zou B, Chim CS, Zeng H, et al. Correlation between the single-site CpG methylation and expression silencing of the XAF1 gene in human gastric and colon cancers. Gastroenterology, 2006, 131:1835-1843.

[8] Ma TL, Ni PH, Zhong J, et al. Low expression of XIAP associated factor 1 in human colorectal cancers. Chin J Dig Dis,2005, 6:10-14.

[9] Novik KL,Nimmrich I,Genc B,et al.Epigenomics:genome-wide study of methylation Phenomena.Curr Issues Mol Biol,2002,4:111-128.

[10] Liston P,Fong WG,Kelly NL,et al.Identification of XAF1 as an antagonist of XIAP anti-Caspase activity.Nat Cell Biol,2001,3:128-133.

[11] 姚寶珍,劉艷紅,王則勝，等.凋亡抑制基因X-相關(guān)細(xì)胞凋亡抑制蛋白基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,24:624-625.

[12] 馬天樂，金承榮，劉曉天，等.XAF1基因與p53基因在結(jié)直腸腫瘤中的表達(dá)研究.中華消化雜志，2005, 25: 351-354.

[13] Xing Z,Zhou Z,Yu R,et al.XAF1 expression and regulatory effects of somatostatin on XAF1 in prostate cancer cells.J Exp Clin Cancer Res,2010,29:162.

[14] Hervouet E,Vallette FM,Cartron PF,et al.Impact of the DNA methyltransferases expression status of apoptosis associated genes in glioblastoma multiforme. Cell Death Dis,2010,1:e8.

[15] Byun DS,Cho K,Ryu BK,et al.Hypermethylation of XIAP-associated factor 1,a putative tumor suppressor gene from the 17p13.2 locus,in human gastric adenocarcinomas.Cancer Res,2003,63:7068-7075.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.019

450052 鄭州，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰腺外科

趙永福，Email:yanghongxing1126@163.com

2012-02-23)

(本文編輯：呂芳萍)