王麗華 高軍 杜奕奇 吳紅玉 金晶 李淑德 李兆申

·論著·

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b和microRNA-29b在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其相關(guān)性

王麗華 高軍 杜奕奇 吳紅玉 金晶 李淑德 李兆申

目的明確胰腺癌細(xì)胞株甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)3b和microRNA-29b(miR-29b)的表達(dá)，分析兩者的相關(guān)性。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2的DNMT3b mRNA和miR-29b表達(dá)。采用Pearson直線相關(guān)分析法分析兩者表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果PANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2的DNMT3b mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.497±0.184、0.420±0.168、0.439±0.217、0.122±0.111和0.731±0.387；miR-29b的相對(duì)表達(dá)量分別為0.745±0.596、0.464±0.430、0.797±1.000、1.836±1.623和0.216±0.335，DNMT3b mRNA的表達(dá)量和miR-29b的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.922，P=0.026)。結(jié)論DNMT3b和miR-29b均參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

胰腺腫瘤； 細(xì)胞系，腫瘤； DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b； 微RNAs

MicroRNA(miRNA)通過與靶基因mRNA上的靶序列互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在多種人類腫瘤中異常表達(dá)。雖然其機(jī)制尚不清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子CpG島異常甲基化在很多腫瘤中與某些miRNAs的下調(diào)有關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族(DNMTs)，尤其是DNMT1和DNMT3b可能參與胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展；胰腺癌患者血漿中存在miRNAs異常表達(dá)，尤其是DNMTs異常表達(dá)的胰腺癌患者血漿miRNAs表達(dá)下調(diào)。本研究檢測(cè)5株胰腺癌細(xì)胞株的DNMT3b和miRNA-29b(miR-29b)表達(dá)，并分析兩者的相關(guān)性，以明確導(dǎo)致胰腺癌DNMT3b異常高表達(dá)的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

一、胰腺癌細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，常規(guī)培養(yǎng)、傳代，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞。

二、實(shí)時(shí)定量PCR

應(yīng)用Trizol(Sigma公司)抽提各胰腺癌細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度。應(yīng)用Takara公司的PrimeScript TMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成DNMT3b的cDNA；采用美國(guó)ABI公司的FG,Taqman(r)microRNA RT Kit逆轉(zhuǎn)錄合成miR-29b的cDNA；DNMT3b及其內(nèi)參18S TAQMAN探針、miR-29b及其內(nèi)參U6 TAQMAN探針均由美國(guó)ABI公司設(shè)計(jì)合成。采用實(shí)時(shí)定量PCR法同時(shí)檢測(cè)DNMT3b mRNA和miR-29b的表達(dá)。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃ 15 s,60℃ 60 s, 40個(gè)循環(huán)。通過計(jì)算得到的RQ值(RQ=2-△△Ct)表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、擴(kuò)增曲線

18S、DNMT3b、U6和miR-29b的擴(kuò)增曲線見圖1。

圖118S(a)、DNMT3b(b)、U6(c)、miR-29b(d)的RT-PCR擴(kuò)增曲線

二、胰腺癌細(xì)胞DNMT3b mRNA和miR-29b 的表達(dá)

PANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2的DNMT3b mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.497±0.184、0.420±0.168、0.439±0.217、0.122±0.111和0.731±0.387；miR-29b的相對(duì)表達(dá)量分別為0.745±0.596、0.464±0.430、0.797±1.000、1.836±1.623和0.216±0.335(圖2)。

圖25株胰腺癌細(xì)胞株DNMT3b mRNA(左)和miR-29b(右)的表達(dá)

三、DNMT3b mRNA和miR-29b表達(dá)的相關(guān)性

5株胰腺癌細(xì)胞株的DNMT3b mRNA表達(dá)量和miR-29b的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.922，P=0.026，圖3)。

圖35株胰腺癌細(xì)胞株DNMT3b mRNA和miR-29b表達(dá)的相關(guān)性

討 論

甲基化修飾是繼基因結(jié)構(gòu)變異即突變和缺失之后的第3種抑癌基因失活機(jī)制，其中一種可能的因素是DNMTs高表達(dá)和DNMTs復(fù)合體調(diào)控障礙[2-3]。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的DNMTs表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，并與抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)相關(guān)[4]。與基因突變引起的癌變不同，由于高度甲基化而導(dǎo)致的抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活并不改變基因本身的序列，因此從理論上說，恢復(fù)基因的正常甲基化狀態(tài)可以重新激活基因的功能。Luczak等[5]應(yīng)用反義DNMTs抑制其表達(dá)，通過減低DNMTs活性使被高甲基化的凋亡基因恢復(fù)活性。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與DNMTs有關(guān)。目前已經(jīng)證實(shí)，miR-29家族主要調(diào)控DNMT1、3a、3b；miR-148主要調(diào)控DNMT-1、3b；miR-143主要調(diào)控DNMT-3a；miR-152主要調(diào)控DNMT1[6-13]。Fabbri等[7]報(bào)道，miR-29家族通過靶向DNMT3a和DNMT3b逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的異常甲基化。Garzon等[8]報(bào)道，在急性淋巴細(xì)胞白血病中，miR-29b通過直接靶向DNMT3a和DNMT3b及間接靶向DNMT1誘導(dǎo)整體的DNA低甲基化，導(dǎo)致腫瘤抑制基因的重新表達(dá)。呂塞群等[14]通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PIC細(xì)胞感染病毒48 h后， DNMT3a和DNMT3b表達(dá)量顯著降低，肝癌細(xì)胞miR-29b的表達(dá)量與DNMT3a、DNMT3b的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果亦顯示，5株胰腺癌細(xì)胞株的DNMT3b mRNA的表達(dá)量和miR-29b的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

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ExpressionofDNMT3bandmicroRNA-29binpancreaticcancercellsandtheirralationship

WANGLi-hua,GAOJun,DUYi-qi,WUHong-yu,JINJing,LIShu-de,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,ChinaCorrespondingauthor：LIZhao-shen,Email:lizhaoshen111@yahoo.com.cn；LIShu-de,Email：lishude57@126.com

ObjectiveTo investigate the expression of DNMT3b mRNA and microRNA-29b (miR-29b) in pancreatic cancer cells and analyze their relationship.MethodsReal-time RT-PCR method was used to detect the expression of DNMT3b mRNA and miR-29b in five pancreatic cancer cell lines (PANC1, BxPC3, CFPAC, AsPC 1, Capan 2) and the relationship between DNMT3b mRNA and miR-29b expression was analyzed by pearson linear correlation method.ResultsThe expression of DNMT3b mRNA in PANC1, BxPC3, CFPAC, AsPC 1, Capan 2 were 0.497±0.184, 0.420±0.168,0.439±0.217,0.122±0.111 and 0.731±0.387, while the expression of miR-29b were 0.745±0.596, 0.797±1.000,0.464±0.430,1.836±1.623 and0.216±0.335. The expression of DNMT3b mRNA was negatively correlated with the expression of miR-29b (r= -0.922,P=0.026).ConclusionsBoth DNMT3b and miRNA29b are involved in the carcinogenesis of pancreatic cancer, and they are negatively correlated.

Pancreatic neoplasms; Cell line, tumor; DNA-methy1transferases3b; MicroRNAs

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.008

國(guó)家自然科學(xué)基金重大國(guó)際合作項(xiàng)目(3091010-3911)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email:lizhaoshen111@yahoo.com.cn；李淑德，Email:lishude57@126.com

2012-05-16)

(本文編輯：屠振興)