郝 波,林 艷,張國(guó)新,施瑞華

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京,210029)

人宮頸癌癌基因(HCCR)是由韓國(guó)學(xué)者Ko等[1]運(yùn)用差異顯示RT-PCR方法從宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞株中篩選出的一種癌基因。該基因定位于人染色體12q,按照分子特性不同該基因可分為HCCR-1和HCCR-2兩種亞型,HCCR2缺乏HCCR1中的外顯子1。其相應(yīng)的蛋白為選擇剪接變構(gòu)體,其中HCCR1編碼360個(gè)氨基酸的多肽,分子量為42 kDa;HCCR2編碼304個(gè)氨基酸,分子量為36 kDa[2]。研究報(bào)道[3]盡管HCCR發(fā)現(xiàn)于人宮頸癌,但在宮頸癌患者血清中未見(jiàn)升高,在肝癌患者血清中卻異常升高。本研究利用HCCR重組蛋白免疫BALB/c小鼠,制備抗人HCCR單克隆抗體(mAb),并進(jìn)行相關(guān)鑒定,為進(jìn)一步深入研究HCCR的生物學(xué)功能和致癌相關(guān)機(jī)制打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組pMBP-c-HCCR-His融合蛋白由本課題組制備,內(nèi)含MBP和His雙重標(biāo)簽[4]。人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所,小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞系由南京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生部抗體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。8周齡清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠,由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。IPTG、HT和HAT培養(yǎng)基、完全/不完全弗氏佐劑、聚乙二醇、PEG4000和ImmunoType鼠mAb分型試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。蛋白A免疫親和層析柱為Pharmacia公司產(chǎn)品。1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司。胎牛血清購(gòu)自hyclone公司。FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗購(gòu)自Inc.,Eugene。

1.2 方法

1.2.1 免疫BALB/c小鼠:①取1g純化的HCCR融合蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE,再電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,切下含相應(yīng)蛋白的PVDF膜,采用脾內(nèi)包埋法,包埋到5只8周齡BALB/c小鼠脾內(nèi)。②2周后加強(qiáng)免疫,將HCCR蛋白(50 g/只)與福氏不完全佐劑充分乳化,按0.2 mL/只腹腔注入BALB/c小鼠內(nèi)。③2周后再次加強(qiáng)免疫,10 d后眼靜脈放血0.2 mL,分離血清,ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中的抗體效價(jià),Western blot方法檢測(cè)其特異性。細(xì)胞融合前3 d,再次腹腔注射3×106/只,進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.2.2 雜交瘤細(xì)胞的制備和篩選:常規(guī)制備飼養(yǎng)細(xì)胞,接種96孔培養(yǎng)板,1×105個(gè)細(xì)胞/孔。取最后一次加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞,采用PEG 4000細(xì)胞融合法,將處于生長(zhǎng)旺盛期、外觀形態(tài)良好的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠脾細(xì)胞按1∶5的比例進(jìn)行融合。融合后的細(xì)胞以HAT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),5 d后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基,10 d后以HT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。HT培養(yǎng)液培養(yǎng)1周,再換成常規(guī)含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),待倒置顯微鏡下可見(jiàn)大的細(xì)胞克隆形成時(shí),用間接ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清以篩選陽(yáng)性克隆:分別用純化蛋白MBP-HCCRHis和MBP-His進(jìn)行包備,取抗體檢測(cè)MBPHCCR-His(+)/MBP-His(-)的陽(yáng)性孔細(xì)胞再進(jìn)行兩次克隆化培養(yǎng),將兩次檢測(cè)皆為陽(yáng)性的細(xì)胞立即進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)良好,分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),凍存保種。

1.2.3 抗人HCCR mAb制備和純化:取10周齡的BALB/c小鼠,腹腔注射0.5 mL無(wú)菌液狀石蠟。1周后,取生長(zhǎng)旺盛的其中1株雜交瘤細(xì)胞,用PBS調(diào)整濃度為2×105個(gè)/mL,無(wú)菌條件下將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔,5～10 d采集腹水離心,12000 r/min,5 min,除去細(xì)胞成分和其他沉淀物,收集上清,用間接ELISA檢測(cè)純化單抗效價(jià)。10 mL腹水加等量的結(jié)合緩沖液(1.5 mol/L甘氨酸,pH 9.0)稀釋后,過(guò) Protein ASepharoseC L-4B親和層析柱,上樣結(jié)束用結(jié)合緩沖液洗柱直到雜蛋白洗凈,再用洗脫液(0.2 mol/L甘氨酸,pH3.0)洗脫,分管收集流出液,并用Tris-Cl(1 mol/L,pH 9.0)進(jìn)行中和,然后測(cè)量紫外280 nm的OD值,合并蛋白質(zhì)高峰管,用PBS透析。

1.2.4 抗人HCCR mAb生物學(xué)特性的分析和鑒定:①抗人HCCRmAb亞型的鑒定:取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用 Roch公司提供的 IsoS-tripTM鼠mAb亞類檢測(cè)試劑盒進(jìn)行IgG亞類鑒定。具體操作過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。②抗人HCCR mAb的特異性鑒定:Western-blot法:將純化的重組人HCCR蛋白(分別加入蛋白2.0、4.0、8.0 μ g/每孔)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h。用抗人HCCR mAb(1∶400)4℃條件下過(guò)夜,加入羊抗鼠IgG-HRP抗體(1∶5000稀釋),室溫下孵育1 h,用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。細(xì)胞免疫熒光:常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2,進(jìn)行細(xì)胞爬片,丙酮固定20 min,滴加3%的H2O2溶液1滴,室溫下孵育15 min。滴加抗人HCCR一抗(1∶200稀釋),37℃恒溫箱孵育1 h。PBS洗滌后滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶100稀釋)進(jìn)行孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.5 間接 ELISA法的建立:以5 μ g/mL HCCR蛋白進(jìn)行包被,采用間接ELISA法檢測(cè)HCCR蛋白的最佳配伍HCCR抗體。

2 結(jié) 果

2.1 特異性分泌鼠抗人HCCR mAb的雜交瘤細(xì)胞株的建立

免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)融合10天后,經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆和克隆后,成功篩選出2株分泌抗人HCCR mAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別進(jìn)行編號(hào)和凍存。3個(gè)月后雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)液氮凍存多次復(fù)蘇傳代,仍生長(zhǎng)良好,分泌抗體性能穩(wěn)定。

2.2 腹水效價(jià)的測(cè)定及抗人HCCR mAb的純化

收取小鼠腹水,經(jīng)蛋白A親合層析純化和透析后獲得抗人HCCR mAb。用間接ELISA檢測(cè)腹水和純化單抗效價(jià),以未免疫的小鼠血清為陰性對(duì)照,根據(jù)吸光度值/陰性對(duì)照測(cè)定值≥2.1,判定腹水中效價(jià)為1∶106,純化單抗效價(jià)1∶105(圖 1)。

圖1 ELISA法測(cè)定效價(jià)

2.3 單克隆抗體性質(zhì)和特異性鑒定

抗人HCCR mAb亞類鑒定:結(jié)果顯示為IgG1類。Western-blot檢測(cè)結(jié)果:通過(guò)Western-blot分析,在42KD位置出現(xiàn)特異性條帶,表明純化抗人HCCR mAb可與HCCR蛋白特異性結(jié)合,提示制備的抗人HCCR mAb具有較好的特異性(圖2)。

圖2 HCCR單克隆抗體Western-blot檢測(cè)結(jié)果

2.4 細(xì)胞免疫熒光

結(jié)果顯示肝癌HepG2細(xì)胞中胞漿和胞膜均呈陽(yáng)性染色,而胞核未見(jiàn)染色(圖3)。

圖3 肝癌HepG2細(xì)胞免疫熒光染色 400倍

2.5 間接ELISA法的靈敏度

根據(jù)吸光度值/陰性對(duì)照測(cè)定值≥2.1的判定標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)不同稀釋度的HCCR抗體,其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1 μ g/L。

3 討 論

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其患者死亡率高且預(yù)后差,嚴(yán)重威脅著人類健康。目前甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)仍是血清學(xué)診斷肝癌的主要手段,但該方法仍有一定的局限性[5-6]。因此尋找更特異、敏感的腫瘤血清學(xué)標(biāo)志物和診斷方法對(duì)肝癌的診斷、療效的判定、腫瘤的復(fù)發(fā)及患者生存期的判斷具有重要意義。

目前文獻(xiàn)報(bào)道[3]HCCR可在白血病、乳腺癌、腎癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌和子宮癌等多種腫瘤中過(guò)量表達(dá),提示HCCR在腫瘤的發(fā)生中起重要的作用,并且發(fā)現(xiàn)HCCR可能是肝癌、乳腺癌早期診斷的標(biāo)志物[7]。進(jìn)一步研究研究發(fā)現(xiàn)用含HCCR-1的pcDNA3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)NCI-H460和RKO細(xì)胞可使抑癌基因p53異常高表達(dá),但與p53相關(guān)基因 p21WAF1、MDM2、Bax表達(dá)下調(diào)或失活,表明HCCR可作為P53的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。Kim等[3]利用ELISA檢測(cè)570例血清標(biāo)本發(fā)現(xiàn)HCCR對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷敏感性為78.2%,特異性為95.7%,而AFP敏感性為僅64.6%。52例AFP陰性的肝癌患者中40例HCCR顯示為陽(yáng)性,在直徑<2 cm肝細(xì)胞癌患者的陽(yáng)性率為69.2%,比AFP陽(yáng)性率要高,表明HCCR可以作為肝癌敏感的診斷標(biāo)志物,特別在早期肝癌及小肝癌的敏感性可能優(yōu)于AFP。

作者通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室自己制備的HCCR抗原免疫BALB/c小鼠,利用雜交瘤技術(shù)篩選并制備了兩株能分泌高效價(jià)抗HCCR mAb,為進(jìn)一步對(duì)HCCR生物學(xué)功能和高效價(jià)抗體作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。本研究在檢測(cè)雜交細(xì)胞上清時(shí),分別用純化蛋白MBP-HCCR-His和MBP-His進(jìn)行間接ELISA包被,成功篩選出MBP-HCCRHis(+)和MBP-His(-)細(xì)胞上清的陽(yáng)性克隆孔,有效地避免MBP和His載體蛋白非特異反應(yīng)的干擾,較好的增加了雜交瘤細(xì)胞的特異性。我們利用Western-blot和免疫熒光方法對(duì)HCCR mAb進(jìn)行了初步驗(yàn)證,結(jié)果顯示HCCR mAb可與HCCR蛋白特異性反應(yīng),表明本實(shí)驗(yàn)室制備的HCCR mAb具有較高特異性。

綜上所述,本研究成功獲得了2株持續(xù)穩(wěn)定分泌抗人HCCR mAb的雜交瘤細(xì)胞株,為進(jìn)一步深入研究HCCR的生物學(xué)功能和致癌相關(guān)機(jī)制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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