隋曉斌，王麗平，王安利

（1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510631；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院河口與海岸帶創(chuàng)新基地 北京 100012）

一株熒蒽降解菌的篩選及其特性研究＊

隋曉斌1，王麗平2，王安利1

（1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510631；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院河口與海岸帶創(chuàng)新基地 北京 100012）

從天津新港潮間帶沉積物中篩選出一株能以熒蒽為唯一碳源和能源且生長(zhǎng)良好的菌株Y1，并對(duì)菌株特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Y1為革蘭氏陰性菌，適合在低鹽度（＜1%氯化鈉）的環(huán)境中生長(zhǎng)，最適p H值為6～7，最適的生長(zhǎng)溫度為25℃～28℃。該菌株對(duì)鋅、鉛、銅、鉻和低濃度的鎘均有抗性，但對(duì)高濃度的鎘十分敏感；菌株Y1對(duì)常見(jiàn)抗生素卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素和利福平具一定抗性，但對(duì)四環(huán)素較敏感。通過(guò)對(duì)菌株Y1的16 S r DNA測(cè)序和序列比對(duì)，并結(jié)合其生理生化特性確定其為Sediminibacterium sp.，歸屬于鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria）。Y1在10天內(nèi)對(duì)熒蒽的降解率為14%，且GST酶在Y1降解熒蒽的過(guò)程中起著重要的作用。

微生物降解；多環(huán)芳烴；潮間帶

多環(huán)芳烴（poly－aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類高分子量有機(jī)化合物的統(tǒng)稱。這類化合物含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)，極難溶于水，在環(huán)境中很難被降解。一些研究表明PAHs具有潛在的毒性，表現(xiàn)在它對(duì)生物體具有致癌性、致畸性和致突變性。目前去除環(huán)境中的多環(huán)芳烴的方法有化學(xué)方法、物理方法和生物降解法。物理方法和化學(xué)方法雖然處理十分快速，但容易造成二次污染；生物降解方法即經(jīng)濟(jì)、安全、殘留又少，逐漸得到人們的認(rèn)可。其中微生物由于生長(zhǎng)迅速、變異率高，很容易產(chǎn)生土著的多環(huán)芳烴高效降解菌株［1－6］。

近幾年來(lái)，渤海灣周邊地區(qū)經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展的同時(shí)，也帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，其中一些污染物已經(jīng)超出了本地環(huán)境自身的調(diào)節(jié)能力，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)健康構(gòu)成一定的威脅，阻礙了渤海灣經(jīng)濟(jì)的健康可持續(xù)發(fā)展。PAHs是渤海灣潮間帶沉積物中的主要污染物之一，且沿岸區(qū)含量較高［7］，其中含4個(gè)苯環(huán)的熒蒽是主要的PAHs污染物之一［8］。渤海灣潮間帶中高濃度的熒蒽可能會(huì)引起本地微生物菌株發(fā)生突變而形成可以高效降解熒蒽的菌體。因此，我們從受PAHs污染嚴(yán)重的天津新港區(qū)潮間帶采集表層沉積物以多環(huán)芳烴熒蒽為唯一能源和碳源，篩選優(yōu)勢(shì)降解菌株，并對(duì)其生理生化特性、生長(zhǎng)特征和降解效能等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為以后的生物原位修復(fù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源和培養(yǎng)基

1.1.1 樣品來(lái)源

從天津新港區(qū)潮間帶采集表層沉積物，放于經(jīng)紫外消毒過(guò)的自封袋中，4℃保存待用。

1.1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，牛肉膏3，蛋白胨5。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（g/L）：硝酸銨1.0；磷酸氫二鉀0.5；磷酸二氫鉀0.5；七水硫酸鎂0.5；氯化鈉1.0；氯化鈣0.1；三氯化鐵0.02；酵母膏0.05；p H值7.0～7.2。固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。用丙酮配置20 mg/m L熒蒽母液，0.22μm濾膜除菌，加入滅菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中作為唯一碳源。

1.2 熒蒽降解菌的篩選、純化

稱取5 g沉積物樣品，放入盛有100 m L熒蒽無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的250 m L三角瓶中，放到搖床上30℃、150 r/min避光富集培養(yǎng)，5天后直接轉(zhuǎn)移10 m L培養(yǎng)液至另一新的含熒蒽無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，之后采用逐步提高熒蒽濃度的方法（最終為100 mg/L），轉(zhuǎn)移5次后獲得富集培養(yǎng)物。

將富集培養(yǎng)物經(jīng)系列稀釋后，在含熒蒽的固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離，于恒溫培養(yǎng)箱中28℃避光倒置培養(yǎng)，直至平板上出現(xiàn)單個(gè)菌落，挑選生長(zhǎng)最好的優(yōu)勢(shì)菌落（命名為Y1）進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1.3 形態(tài)觀察

1.3.1 顯微鏡觀察

采用光學(xué)顯微鏡（Olympus）進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.3.2 掃描電鏡觀察

在無(wú)菌條件下挑取適量菌體立刻用以p H值7.4磷酸緩沖液配制的2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，然后經(jīng)過(guò)乙醇系列脫水、常規(guī)臨界點(diǎn)干燥、樣品粘貼和真空鍍膜后，在掃面電鏡下觀察。

1.4 菌株生理生化指標(biāo)的測(cè)定

對(duì)菌株進(jìn)行系列生理生化特性試驗(yàn)，主要包括甲基紅（M.R.）試驗(yàn)、乙酰甲基醇（V.P.）試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)以及吲哚試驗(yàn)等，每組兩個(gè)平行。

1.5 環(huán)境條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

1.5.1 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將所篩選菌株活化24 h后，接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中，分別在4℃、20℃、28℃、30℃、37℃和45℃的溫度下培養(yǎng)24 h，用722分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm時(shí)的光密度值（OD600），每組兩個(gè)平行。

1.5.2 p H值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

用1 mol/L的氫氧化鈉和1 mol/L的鹽酸將營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的p H值分別調(diào)至4、5、6、7、8和10。將待測(cè)菌株活化24 h后接入上述培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)24 h，用722分光光度計(jì)測(cè)定不同p H值條件下菌懸液的OD600值，每組兩個(gè)平行。

1.5.3 鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株活化24 h后，分別接種于含0、1%、2%、3%、5%、8%和10%氯化鈉（NaCl）的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)24 h，用722分光光度計(jì)測(cè)定鹽度下菌懸液的OD600值，每組兩個(gè)平行。

1.6 對(duì)抗生素和重金屬的抗性實(shí)驗(yàn)

取0.1 m L制備好的菌懸液接種于固體培養(yǎng)基中，用無(wú)菌玻璃刮涂抹均勻，將滅菌濾紙浸入供試試劑中，用無(wú)菌鑷子夾取浸藥濾紙片（提前將濾紙瀝干），分別平鋪于含菌體平板上，并做好記號(hào)，28℃下培養(yǎng)72 h后，觀察濾紙片周圍有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，每組兩個(gè)平行。

選擇5種常用抗生素進(jìn)行敏感試驗(yàn)，其濃度為：卡那霉素，10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L；氨芐青霉素，100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L；鏈霉素，10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；四環(huán)素，10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；利福平，10 mg/L、60 mg/L和100 mg/L。

金屬離子及其濃度如下：鎘（Cr6＋），10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；鋅（Zn2＋），100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L；鉛（Pb2＋），100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L；銅（Cu2＋），10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；鉻（Cd2＋），20 mg/L、50 mg/L和100 mg/L。

1.7 菌株DNA的提取和PCR擴(kuò)增

挑取適量菌株于100μL無(wú)菌去離子水中，采用水煮法快速提取細(xì)菌基因組DNA，離心取上清液作為PCR擴(kuò)增的待用模版，用于16 S r DNA基因的擴(kuò)增。所用引物為27 F（5’－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3’）和1 492 r（5’－GGC TACCTTGTTACGACTT－3’），反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測(cè)，將純的樣品送至上海英俊公司回收并測(cè)序。將16 S r DNA的測(cè)序結(jié)果輸入基因庫(kù)（GenBank）中進(jìn)行序列比對(duì)。

1.8 降解效能的測(cè)定

將菌株在液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中活化24 h后，取0.6 m L菌液至裝有12 m L無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后加入12μL熒蒽母液，采用液相色譜（HPLC）測(cè)定培養(yǎng)瓶中熒蒽初始濃度。然后將3個(gè)平行樣品放在150 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10天后，采用液相色譜（HPLC）測(cè)定培養(yǎng)液中熒蒽濃度的變化。

1.9 菌株蛋白質(zhì)含量和GST酶活性的測(cè)定

菌株蛋白質(zhì)采用考馬斯亮蘭法測(cè)定；GST酶活性采用GST酶試劑盒測(cè)定（南京建成生物工程研究所），該試劑盒是通過(guò)檢測(cè)GSH濃度的高低來(lái)反應(yīng)GST活力的大小，GSH（底物）濃度越低則GST活力越大。

2 結(jié)果

2.1 菌株的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)

菌株Y1為革蘭氏陰性菌，在固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上菌株淡黃色、圓形、不透明和邊緣規(guī)則；在以熒蒽為唯一碳源的固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上菌株呈白色、半透明和邊緣規(guī)則。在掃描電鏡下菌體細(xì)胞為桿狀（圖1），其部分生理生化特征見(jiàn)表1。

圖1 菌株Y1個(gè)體形態(tài)的掃描電鏡觀察

表1 菌株Y1的部分生理生化特征

2.2 環(huán)境條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

（1）溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。由圖2可知，菌株Y1在不大于20℃和不小于37℃條件下生長(zhǎng)較差，而在25℃～28℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)最好。

（2）鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。由圖3可見(jiàn)，隨著鹽度的增加，菌株Y1生長(zhǎng)狀況逐漸變差，在NaCl濃度為1%時(shí)，生長(zhǎng)較差；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到3%時(shí)細(xì)菌幾乎不能生長(zhǎng)。因此菌株Y1在小于1%NaCl的低鹽度環(huán)境下生長(zhǎng)較好。

（3）p H值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。圖4表明，菌株Y1在p H值小于5和p H值大于9的條件下幾乎不能生長(zhǎng)，而在p H值6～8范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，其中在p H值6～7之間生長(zhǎng)最好。

2.3 菌株對(duì)抗生素和重金屬的抗性

2.3.1 抗生素試驗(yàn)

菌株Y1對(duì)5種常見(jiàn)抗生素的敏感試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在卡那霉素（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）、鏈霉素（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）、氨芐青霉素（100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）和利福平（10 mg/L、60 mg/L、100 mg/L）4種抗生素的各個(gè)濃度都沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈，說(shuō)明該菌株對(duì)這4種抗生素具一定抗性；四環(huán)素（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）各個(gè)濃度都出現(xiàn)了抑菌圈，說(shuō)明菌株對(duì)這種抗生素比較敏感。

2.3.2 重金屬試驗(yàn)

菌株Y1對(duì)5重金屬離子抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：Zn2＋（100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）、Cu2＋（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）、Cd2＋（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）和Pb2＋（100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）4種金屬測(cè)定的濃度中都沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn)，說(shuō)明該菌株對(duì)這4種離子有耐受性；在Cr6＋試驗(yàn)中，濃度為10 mg/L時(shí)沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn)，但在濃度升至20 mg/L和50 mg/L的試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)了抑菌圈，說(shuō)明菌株Y1對(duì)低濃度的Cr6＋有抗性，但對(duì)高濃度的Cr6＋很敏感。

2.4 16SrDNA基因的擴(kuò)增和序列分析

利用細(xì)菌16 S r DNA引物27 f和1 492 r進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1 500 bp左右大小的PCR產(chǎn)物，符合預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度，純化產(chǎn)物并且測(cè)定產(chǎn)物的序列，將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與Sediminibacterium sp.的同源性為95%。

2.5 菌株對(duì)熒蒽的降解率試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，3個(gè)平行樣品經(jīng)過(guò)10天培養(yǎng)后熒蒽濃度分別降低了16%、14%和18%。

表2 菌株Y1對(duì)熒蒽的降解效能

2.6 熒蒽對(duì)菌株Y1蛋白質(zhì)含量和GST酶活性的影響

取活化24 h后的菌液分別接種到營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基和以熒蒽為唯一碳源的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后，取適量菌液，超聲波破碎后進(jìn)行菌體蛋白質(zhì)含量和GST酶活性的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。由表3可見(jiàn)，經(jīng)熒蒽誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其菌體蛋白質(zhì)含量和GST酶活性都明顯提高。

表3 熒蒽降解菌液蛋白質(zhì)含量和GST酶活性測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

從受污環(huán)境中分離、篩選出高效降解菌株，是生物修復(fù)受污環(huán)境的第一步，也是關(guān)鍵的一步［9］，了解其生物學(xué)特性是利用降解性微生物進(jìn)行原位修復(fù)的必要理論基礎(chǔ)。筆者從天津新港區(qū)渤海灣潮間帶篩選出一株具有降解多環(huán)芳烴熒蒽能力的土著優(yōu)勢(shì)菌株，并對(duì)其生長(zhǎng)和降解特性進(jìn)行了研究。環(huán)境條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響為摸索菌株的培養(yǎng)條件及其在環(huán)境中的適應(yīng)性提供實(shí)踐依據(jù)。筆者所篩選菌株Y1，在小于1%NaCl、25℃～28℃和p H值6～8生長(zhǎng)最好，同時(shí)對(duì)常見(jiàn)抗生素和重金屬都具一定抗性，10天內(nèi)對(duì)熒蒽的降解率在14%～18%。天津新港高潮帶鹽度較低，p H值一般在7～8之間，因此初步認(rèn)為本次所篩選熒蒽降解菌株Y1較適合在春末夏初和秋季（25℃～28℃）用于天津新港潮間帶多環(huán)芳烴污染的微生物原位修復(fù)，但其在自然環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況和降解效能仍待于進(jìn)一步研究。

rRNA廣泛存在于真核和原核生物中，功能穩(wěn)定，由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成。將待測(cè)菌株提取其遺傳物質(zhì)，經(jīng)測(cè)序、BLAST比對(duì)，并結(jié)合其生理生化特征，對(duì)菌株加以鑒定是目前應(yīng)用最為普遍的鑒定方法。筆者在對(duì)所篩選菌株進(jìn)行一系列生理生化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用16 S r RNA同源性序列分析方法鑒定所篩選菌株的種類。16 S r RNA大小為1 500 bp左右，所代表的信息量能反映生物界的進(jìn)化關(guān)系。筆者采用27 f和1 492 r引物對(duì)擴(kuò)增所提取菌株總DNA，經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序，將序列正確拼接后獲得1 620 bp的遺傳序列，經(jīng)BLAST比對(duì)后菌株被鑒定為Sediminibacterium sp.，歸屬于鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria）。為進(jìn)一步確定菌株Y1對(duì)熒蒽的降解能力，我們測(cè)定了10天內(nèi)該菌株對(duì)熒蒽的降解效能。采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定熒蒽濃度的變化，結(jié)果證實(shí)菌株Y1對(duì)熒蒽有較高的降解能力。另外，研究表明：在PAHs降解過(guò)程中，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）在其中起著重要的作用，曾有人將GST酶作為PAH降解菌存在的分子探針［10－11］。筆者對(duì)菌株Y1的蛋白含量和GST酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入熒蒽后，菌體的蛋白含量和GST酶活性明顯提高，表明菌體產(chǎn)生了大量與降解多環(huán)芳烴相關(guān)的蛋白和酶類。

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