夏文靜， 黃藝儀， 何建桂， 陳藝莉

(中山大學附屬第一醫(yī)院 1心內科，2急診科，廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)05-0852-06

2011-09-01

2012-03-14

廣東省科學技術廳科研項目(No. 2010B031600065)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8140; E-mail: hejiangui19640114@163.com

▲并列第1作者

急性心肌缺氧對乳鼠心肌細胞腦鈉尿肽表達的影響及其作用機制*

夏文靜1▲， 黃藝儀2▲， 何建桂1△， 陳藝莉1

(中山大學附屬第一醫(yī)院1心內科，2急診科，廣東 廣州 510080)

目的觀察急性缺氧損傷對乳鼠心肌細胞腦鈉尿肽(BNP)表達水平的影響并探討其可能作用機制。方法原代乳鼠心肌細胞缺氧、無糖、無血清培養(yǎng)以模擬心肌缺血損傷，利用CCK-8法測細胞存活率、ELISA法測白細胞介素-6(IL-6)和BNP的表達；以IL-6直接干預體外培養(yǎng)的心肌細胞， 采用RT-PCR、Western blotting和ELISA方法觀察BNP、轉化生長因子β1(TGF-β1)、Smad2 mRNA的轉錄和蛋白的表達。結果缺氧顯著上調IL-6和BNP的表達，且兩者呈線性正相關；IL-6直接干預可劑量和時間依賴性地上調心肌細胞BNP的mRNA和蛋白表達水平，同時TGF-β1和Smad2的表達水平亦增加；而針對TGF-β1的中和抗體能夠部分地抑制由IL-6引起的BNP表達增加。結論急性心肌缺氧可直接上調BNP的表達水平，這種調節(jié)效應與TGF-β1/Smad2信號通路上調有關。

缺氧； 鈉尿肽，腦； 白細胞介素-6； 轉化生長因子β； Smad2通路

由于其重要的生物學效應和標志物價值，腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)近年來受到越來越多的關注。既往研究報道，在充血性心力衰竭等病理經過中，BNP合成受心肌細胞張力影響；細胞張力已被證實是BNP合成和釋放的主要調節(jié)因子和血流動力學指標[1]。然而，無心力衰竭的心血管疾病患者，如急性心肌缺氧[2]和急性冠脈綜合癥[3]，無論左心室射血功能正常與否，也表現(xiàn)出BNP水平升高，其調節(jié)機制不明。

de Bold等[4]證實在心臟移植排斥反應中，被激活的T淋巴細胞產生如腫瘤壞死因子α和白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)的炎癥因子，可選擇性上調BNP的分泌；多項研究亦報道，急性心肌梗死的患者[5]和接受冠狀動脈前降支結扎以重復心肌梗死模型的大鼠[6]，血漿中升高的IL-6水平與升高的BNP呈相關性。既往研究已證實心肌缺血、心肌梗死等病理經過有炎癥反應和各種炎癥因子的參與[7]，但炎癥反應是否參與心肌缺血時BNP的合成調節(jié)尚未見報道。

轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)是一種源于血小板的、多種器官表達的炎癥因子，參與調節(jié)炎癥反應、細胞增殖等；Smad蛋白是其下游重要的信號因子[8]。我們的前期研究已證實TGF-β1/Smad2信號通路在BNP改善心肌梗死后心室重塑中發(fā)揮重要作用[9]，但其是否參與BNP合成過程尚未見相關報道。本研究旨在通過建立缺氧損傷的細胞模型，觀察無細胞張力影響缺氧是否直接影響B(tài)NP合成水平并且炎癥反應是否參與該過程；通過IL-6干預實驗探討急性心肌缺氧時BNP合成的調節(jié)機制和相關信號通路。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，1～2 d齡，由中山大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2004-0011。

1.2主要試劑 Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(Dojindo)； BNP ELISA試劑盒(R&D Systems)；IL-6 ELISA試劑盒(ExCell Biology)；重組大鼠IL-6(PeproTech)；TGF-β1中和抗體(Sigma)；Trizol reagent(Invitrogen)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa Biotechnology) ；One-Step RT-PCR試劑盒(TaKaRa Biotechnology) TGF-β1抗體(Santa Cruz Biotechnology)；Smad2抗體(Cell Signal Technology)；GAPDH抗體(Cell Signal Technology)；其它生化試劑均為進口分裝或者國產分析純。

1.3主要器材 酶標儀(Tecan Sunrise)；紫外凝膠檢測和成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；PCR儀(MT Research)；NIH圖像處理系統(tǒng)。

2方法

2.1原代心肌細胞培養(yǎng) 出生1～2 d的SD乳鼠消毒，取心室肌，以D-Hanks液洗去血污，剪碎為1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，清洗；加入5倍組織體積的0.125%胰酶，37 ℃靜置消化10 min，清洗后取沉淀；加入5倍組織體積的0.01%Ⅰ型膠原酶，37 ℃振蕩消化150 min，以含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化，吹打制細胞懸液直到組織塊消失；800 r/min、4℃離心10 min，棄上清，重復2～3次；以含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基懸浮細胞，經200目篩網過濾去除雜質。按差速貼壁分離法37 ℃、5%CO2孵育50～60 min，純化心肌細胞。細胞計數(shù)，以1×106密度接種于6孔板或以5×105密度接種于96孔板，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。加入0.1 mmol/L BrdU以抑制成纖維細胞生長，接種4～6 h后細胞開始貼壁，接種18～24 h出現(xiàn)有規(guī)律的細胞搏動。

2.2模擬心肌缺氧模型 細胞預先以不含血清的DMEM-F12培養(yǎng)基饑餓24 h。對于缺氧組，參考文獻[10]，將高純度氮氣通入無糖的平衡鹽溶液(118 mmol/L NaCl, 24 mmol/L NaHCO3,16 mmol/L KCl, 1.0 mmol/L KH2PO4, 2.5 mmol/L CaCl2, 1.2 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L Na-EDTA, 20 mmol/L 乳酸鈉, pH 6.4) 30 min，以驅除氧氣；將細胞換以氮氣飽和的平衡鹽溶液，置于可密封的缺氧盒中，先將含95%氮氣和5%二氧化碳的混合氣通入盒內5～10 min趕走盒內空氣，再持續(xù)充入混合氣15～20 min，密封缺氧盒并置于37 ℃條件下培養(yǎng)模擬缺氧環(huán)境。對于對照組，換以無血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.3CCK-8法檢測細胞存活率 按照試劑盒說明書處理細胞，450 nm作為檢測波長，650 nm作為校正波長。細胞存活率計算公式為：[處理組吸光度(A)值-空白孔A值]/(對照組A值-空白孔A值)。

2.4ELISA法檢測BNP和IL-6水平 按照試劑盒說明書處理細胞，450 nm作為檢測波長，630 nm作為校正波長。

2.5IL-6干預細胞 細胞預先以不含血清的DMEM-F12培養(yǎng)基饑餓24 h。以不同濃度IL-6(5、25和100 μg/L)干預細胞24 h；以IL-6(5 μg/L)干預細胞不同時間(12、24和48 h)；預先以不同濃度中和抗體(10、40和50 mg/L)處理細胞，1 h后再加入IL-6(5 μg/L)干預細胞24 h。

2.6RT-PCR檢測BNP、TGF-β1和Smad2 mRNA表達 收集細胞，采用Trizol法抽提總RNA，核酸測定儀測A260/A280，要求在1.8～2.0之間。按照試劑盒說明書采用隨機引物進行逆轉錄合成cDNA。采用One-step RT-PCR(TaKaRa)擴增目的基因，引物的序列見表1。以β-actin為內參照。擴增條件為：BNP和TGF-β1，首次循環(huán)95 ℃ 5 min，隨后進行33次循環(huán)：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃ 5 min；Smad2和β-actin, 首次循環(huán)95 ℃ 5 min，隨后進行32次循環(huán)：95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃ 5min。PCR產物分析：取9 μL產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，分別用BNP、TGF-β1、Smad2和β-actin擴增條帶的面積比評定其mRNA水平。

表1BNP、TGF-β1、Smad2和β-actin的引物序列

Table 1. Primer sequences of BNP,TGF-β1,Smad2 and β-actin used for RT-PCR

GenenamePrimersequenceProduct(bp) BNPForward:5-GGGCTGTGACGGCTGAGGT-3256Reverse:5-AGTTTGTGCTGGAGATAGA-3TGF-β1Forward:5-GATGCCGTTCCGAGGCAGAT-3299Reverse:5-CCTGAGACGTCAGCAAGACAG-3Smad2Forward:5-ACTATACCCACTCCATTCCA-3388Reverse:5-CACTATCACTTAGGCACTCG-3β-actinForward:5-CCTTCCGTGATGGAAGGCT-3207Reverse:5-GCAGCAGATCATCGTGATCT-3

2.7Western blotting檢測TGF-β1和Smad2蛋白表達 取處理的心肌細胞，凍PBS液洗滌后加入細胞裂解液，冰上裂解30 min。刮細胞并提取含細胞碎片的裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液進行蛋白濃度測定。取30μg蛋白，進行15% SDS-PAGE電泳，然后65 V 2.5 h轉印至硝酸纖維素膜上。該膜在含10%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗膜后，加入TGF-β1抗體(1∶500)、Smad2抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的IgG抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h。洗膜后ECL試劑顯影。以GAPDH(1∶1 000) 抗體作為內參照。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1缺氧處理降低乳鼠心肌細胞存活率

CCK-8法檢測結果顯示，缺氧2 h、3 h、4 h、5 h和6 h處理的乳鼠心肌細胞活性為95.36% ± 3.61%、74.81% ± 4.43%、52.21% ± 5.34%、41.00% ± 4.92%和26.37% ± 3.56%，缺氧處理后細胞活性隨處理時間延長而下降(P<0.01)，見圖1。這表明所建細胞模型可有效模擬急性心肌缺氧損傷。

圖1缺氧處理降低乳鼠心肌細胞存活率

2缺氧處理增加乳鼠心肌細胞培養(yǎng)上清IL-6和BNP含量

ELISA法檢測結果顯示，缺氧2 h、3 h、4 h、5 h和6 h處理的乳鼠心肌細胞上清液中IL-6和BNP含量均顯著高于對照組，與缺氧處理時間相關，且BNP含量與IL-6表達呈線性正相關(P<0.01)，見圖2。

圖2缺氧處理增加乳鼠心肌細胞分泌IL-6和BNP

3IL-6干預上調乳鼠心肌細胞BNPmRNA和蛋白表達水平

與對照組相比，IL-6干預組乳鼠心肌細胞BNP mRNA和蛋白的表達水平顯著增加(P<0.01)，見圖3，且這種增加呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。

圖3Il-6干預上調乳鼠心肌細胞BNPmRNA和蛋白表達水平

4IL-6干預上調乳鼠心肌細胞TGF-β1和Smad2mRNA和蛋白表達水平

與對照組相比，IL-6干預組乳鼠心肌細胞TGF-β1和Smad2 mRNA和蛋白的表達水平亦顯著增加(P<0.01)，見圖4，且這種增加呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。

5TGF-β1中和抗體可部分抑制IL-6引起的BNP表達上調

10 mg/L非特異性抑制TGF-β1活性的中和抗體可部分抑制IL-6誘導的BNP mRNA和蛋白表達增加(P<0.01)；增加中和抗體濃度并不能完全抑制BNP的增加，抗體濃度在40 mg/L已達到最大抑制效應，見圖5。

圖4IL-6干預上調乳鼠心肌細胞TGF-β1和Smad2mRNA和蛋白表達水平

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，除了影響細胞張力，缺氧亦可使BNP表達增加；由炎癥因子IL-6介導的這種調節(jié)效應與TGF-β1/Smad2通路上調有關。

炎癥反應是許多疾病包括急性心肌缺血的共同病理經過，炎癥因子對疾病發(fā)生發(fā)展的作用不可忽視。在這些炎癥因子中，有些促進炎癥反應和動脈粥樣硬化的發(fā)展，如IL-6；有些具有抗炎和保護心肌的效應，如TGF-β1。促炎因子與抗炎因子的生物學效應相互拮抗、相互協(xié)調，在生理狀態(tài)和可逆轉的病理經過中維持動態(tài)平衡；而不可逆的病理過程中這種平衡被打破，機體即出現(xiàn)功能障礙[11]。

Yamauchi-Takihara等[12]已報道，缺氧、缺氧/復氧刺激均可誘導心肌細胞合成IL-6。Hermonat等[13]研究認為，缺血/再灌注損傷中TGF-β1表達增加是機體減輕組織損傷、提高局部心肌存活率的保護機制。Aukrust等[14]報道充血性心力衰竭的患者，血漿中促炎因子IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)增加，抗炎因子IL-10和TGF-β1下降，且炎癥因子水平的改變程度與患者心功能相關;TGF-β1水平顯著下降因而心衰患者失去了抗炎因子介導的心臟保護效應。

圖5中和抗體可部分抑制IL-6干預引起的BNP表達上調

在本研究中，缺氧處理2～6 h，心肌細胞上清液中IL-6和BNP含量顯著高于對照組，且與處理時間呈正相關；而IL-6處理的心肌細胞BNP、TGF-β1和Smad2表達呈劑量和時間依賴性增加，與既往研究結果一致。我們認為，缺氧刺激下IL-6的產生是機體應對缺氧損傷的炎癥反應的一部分，而由IL-6導致的TGF-β1和BNP水平上調是反饋調節(jié)，亦是一種心肌保護機制。眾所周知，IL-6作為一種重要的促炎因子，通過與多種因子如IL-1、TNF-α的相互作用，參與冠狀動脈粥樣硬化的基本病理經過，促進心肌缺血、心肌梗死至充血性心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展[15]；而TGF-β1作為一種抗炎因子，參與多種生物學效應的調節(jié)，包括炎癥反應、脂質代謝、細胞分化和纖維化，并通過拮抗促炎因子的生物學效應減輕缺血/再灌注病理過程中的心肌損傷[16]；BNP不僅發(fā)揮利鈉、利尿、舒張血管、抗纖維化、抑制腎素和醛固酮釋放的生物學效應，我們的前期研究亦發(fā)現(xiàn)BNP可改善心梗后的心肌肥厚和心室重塑[9]。因而有理由認為急性心肌缺氧時TGF-β1和BNP的增加可拮抗由IL-6介導的炎癥反應，減輕缺氧引起的心肌組織損傷。

以往研究認為BNP表達主要受細胞張力調節(jié)，故而BNP水平僅作為心力衰竭診斷的標志物[17]。結合本研究，我們相信急性心肌缺氧時，炎癥反應中產生的IL-6可直接上調BNP的表達，因而BNP水平增高亦可作為急性心肌缺氧的臨床診斷標志物。BNP合成機制的研究為其臨床應用的拓展提供了實驗依據。

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Effectofacutehypoxiaonexpressionofbrainnatriureticpeptideinneonatalratcardiomyocytes

XIA Wen-jing1, HUANG Yi-yi2, HE Jian-gui1, CHEN Yi-li1

(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofEmergency,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:hejiangui19640114@163.com)

AIM: To explore the influence of acute myocardial hypoxia on the expression of brain natriuretic peptide (BNP) in neonatal rat cardiomyocytes.METHODSTo establish a model of simulated hypoxia injury, the primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes were incubated under the condition of hypoxia in glucose-free balanced salt solution plus serum deprivation. The cell survival rate was analyzed by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) and the levels of interleukin-6 (IL-6) and BNP were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The transcriptional and translational levels of BNP, transforming growth factor β1(TGF-β1) and Smad2 in cardiomyocytes with IL-6 stimulation were determined by RT-PCR, Western blotting and ELISA.RESULTSExposure of the neonatal cardiomyocytes to an oxygen-deficient environment notably increased IL-6 and BNP secretion, and BNP expression was positively correlated with IL-6 expression. Stimulation of the neonatal cardiomyocytes with IL-6 caused time- and dose-dependent up-regulation of transcriptional and translational levels of BNP. This process was accompanied with the up-regulation of TGF-β1/Smad2. Inhibition of TGF-β1activity using a neutralizing antibody partially suppressed the IL-6-stimulated increase in BNP expression.CONCLUSIONAcute myocardial hypoxia directly up-regulates the expression of BNP, which is associated with the up-regulation of TGF-β1/Smad2 signal pathway.

Hypoxia; Natriuretic peptide,brain; Interleukin-6; Transforming growth factor beta; Smad2 pathway

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.015