梁俊清， 徐海波， 陳小娟， 邢志軍， 尹蓓珮， 吳 琨， 張梓倩， 周麗濤， 吳以嶺

(1河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035 ；2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；3第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院國際合作生物信號轉導研究中心，上海 200438；4上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 上海 200040)

1000-4718(2012)05-0846-06

2011-11-21

2012-03-16

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(國家973計劃)項目(No.2012CB518606；No.2005CB523300)；國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81102768)；十二五科技重大專項重大新藥創(chuàng)制課題(No.2011ZX0940-020)

△通訊作者 Tel: 010-59705120; E-mail: liangjunqing1234@163.com

通心絡通過PI-3K/Akt/HIF信號通路改善血管內皮細胞缺氧損傷*

梁俊清1△， 徐海波2， 陳小娟1， 邢志軍2， 尹蓓珮4， 吳 琨3， 張梓倩1， 周麗濤1， 吳以嶺1

(1河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035 ；2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；3第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院國際合作生物信號轉導研究中心，上海 200438；4上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 上海 200040)

目的觀察通心絡對缺氧血管內皮細胞中缺氧誘導因子(HIF)及其上游信號轉導通路PI-3K/Akt的影響，探討PI-3K/Akt/HIF信號通路在通心絡改善血管內皮細胞抗缺氧損傷中的作用。方法將體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)分為常氧對照組、通心絡組、缺氧組和缺氧+通心絡組。采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的活性，Western blotting 檢測HIF-1α、Bcl-2、Mcl-1、Bax表達變化及Akt的磷酸化情況。利用HIF-1α的顯性負性突變體(DN-HIF)瞬時轉染HUVECs，流式細胞儀分析細胞的凋亡情況。利用PI-3K和Akt的顯性負性突變體瞬時轉染HUVECs，探討PI-3K/Akt信號通路在通心絡改善血管內皮細胞抗缺氧損傷中的作用。結果與常氧條件下比較，通心絡對缺氧內皮細胞雖有明顯的促增殖作用，但程度明顯減弱。通心絡可顯著上調HIF-1α、Bcl-2、Mcl-1蛋白表達水平及Akt磷酸化水平，且下調Bax的表達。利用DN-HIF抑制HIF-1α的活化后，通心絡提高缺氧HUVECs活性的程度明顯下降，但仍可一定程度上降低細胞凋亡百分率。進一步利用PI-3K顯性負性突變體(Δp85)和Akt顯性負性突變體(DN-Akt)阻斷HIF-1α上游信號通路PI-3K/Akt后，通心絡上調缺氧HUVECs HIF-1α蛋白表達的作用明顯減弱，促進Akt磷酸化的作用基本消失。結論在缺氧條件下，通心絡上調HUVECs HIF-1α蛋白表達水平，促進抗凋亡因子同時抑制促凋亡因子的表達，降低細胞凋亡率，從而提高缺氧細胞的增殖率，這些作用在一定程度上依賴于PI-3K/Akt/HIF通路的活性。

通心絡； 缺氧誘導因子； 血管內皮細胞； 信號轉導； 缺氧損傷

越來越多的研究表明，在各種心腦血管病的發(fā)病過程中均伴有不同程度的缺氧[1]。缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是缺氧條件下活化的一個異源二聚體的重要轉錄因子，可通過與靶基因上的缺氧反應元件(hypoxia response element，HRE)結合，調節(jié)下游靶基因如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、葡萄糖轉運蛋白(glucose transporters，Glut)等轉錄，從而產生一系列對缺氧的代償反應，促進細胞的生長和代謝[2-5]。通心絡(Tongxinluo,TXL)為純中藥制劑，到目前為止，已有600多萬心腦血管病患者在服用通心絡，其能有效改善穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)作，提高一氧化氮(nitric oxide, NO)水平、保護超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、抑制內皮素(endothelin, ET-1)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的產生[6]。VEGF是目前所知的作用最強的血管生成刺激因子，其基因也是HIF-1的重要靶基因。通心絡可明顯提高反復缺氧小鼠腦組織HIF-1α和VEGF表達，提高小鼠缺氧耐受性[7]。通心絡還可明顯抑制缺氧引起的血管內皮細胞caspase-3活性增高并減少缺氧所誘導的動脈內皮細胞凋亡[8]。但通心絡能否通過影響HIF-1α的表達實現緩解或對抗心腦血管病變中針對缺氧過程帶來的損傷尚未見文獻報道。本研究以缺氧人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為模型，通過分析通心絡對細胞存活率、凋亡率、HIF-1α及其上游信號轉導通路PI-3K/Akt的影響，探討通心絡提高血管內皮細胞抗缺氧損傷能力的分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞 HUVECs購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫。

1.2主要試劑 通心絡超微粉[9](石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號為071201)貯存液的配制：稱取一定量的通心絡超微粉溶解于無血清DMEM培養(yǎng)基中，超聲促溶1 h，6 500×g離心10 min, 收集上清液，應用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，同時將所得沉淀于60 ℃條件下加熱烘干，計算實際溶解于無血清DMEM培養(yǎng)基中通心絡超微粉量，制備成 2 000 mg/L通心絡超微粉貯存液，-20 ℃貯存?zhèn)溆?，實驗前利用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋成100 mg/L，作為給藥濃度。

2主要方法

2.1實驗分組 (1)常氧對照組：于正常條件下進行培養(yǎng)；(2)通心絡組：加入含通心絡超微粉(終濃度為100 mg/L)在正常培養(yǎng)條件下進行孵育，(3)缺氧組：于95%N2+4% CO2+1% O2條件下培養(yǎng)；(4)缺氧+通心絡組：加入含通心絡(終濃度為100 mg/L)的無血清DMEM培養(yǎng)基后，在95%N2+4%CO2+1% O2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2細胞活性的測定 各組分別于缺氧0 h、12 h、24 h、48 h后測定細胞活性，采用CCK-8檢測試劑盒檢測，操作嚴格按照說明書進行。

2.3瞬時轉染 將生長良好的HUVECs以2.5×105cells/well的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%～90%鋪滿時，開始實驗，實驗分為8組：(1)質粒對照組(GFP組)；(2)GFP+TXL組；(3)DN-HIF組；(4)DN-HIF+TXL組；(5)Δp85組；(6)Δp85+TXL組；(7)DN-Akt組；(8)DN-Akt+TXL組。各組均按jetPEI轉染試劑盒的說明書以5 μg顯性負性突變體 GFP、DN-HIF、Δp85和DN-Akt分別進行轉染，12 h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后，(2)、(4)、(6)、(8)組分別加入含通心絡(終濃度為100 mg/L)的無血清DMEM培養(yǎng)基與其余各組在95%N2+4% CO2+1% O2條件下進行培養(yǎng)。

2.4HIF-1α、Bcl-2、Mcl-1、Bax及磷酸化Akt表達的測定 采用Western blotting 檢測目的蛋白的表達。將生長良好的HUVECs以2×105cells/well接種于6孔培養(yǎng)板，37 ℃進行培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%鋪滿時，以含0.1% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h。處理的細胞及對照細胞經預冷的PBS洗滌后，用細胞裂解液于4 ℃裂解5 min。將全細胞裂解產物經30×2 s超聲后進行蛋白定量。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE并轉印至硝酸纖維素膜上，用HIF-1α、Bcl-2、Mcl-1、Bax及磷酸化Akt相應的特異性Ⅰ抗[HIF-1α(1∶1 000)和p-Akt(1∶1 000)單克隆抗體由Santa Cruz提供]進行識別后，以相應的熒光Ⅱ抗和ECF 蛋白印跡分析儀檢測目的蛋白。

2.5細胞凋亡百分率的測定 各組分別于缺氧0 h、12 h、24 h、48 h后測定細胞凋亡率。收集各組細胞，PBS洗2次，70%乙醇固定30 min，PBS洗1次，懸浮于50 μL中，加RNase(2 mL/L)37 ℃、30 min，加PI(10 mg/L)避光染色40 min，過濾。以流式細胞儀(EPICS ELITE ESP)分析凋亡細胞百分比。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1通心絡對缺氧內皮細胞活性的影響

與常氧對照組比較，應用通心絡(100 mg/L)孵育內皮細胞后，隨著時間的延長，其活性呈上升趨勢；與常氧條件下比較，缺氧組內皮細胞活性顯著降低，通心絡干預后各個時點的細胞活性有所增加，以24 h效果最顯著，見表1。

表1 各組內皮細胞活性的變化

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vshypoxia group.

2HIF對通心絡改善細胞活性的影響

與質粒對照組比較，阻斷HIF的表達后，缺氧內皮細胞的活性顯著下降，同時通心絡提高HUVECs活性的程度隨之明顯下降，見圖1。

3通心絡對HIF-1α表達及Akt磷酸化水平的影響

Western blotting結果顯示，與對照組比較，缺氧組HIF-1α的表達呈現一定程度升高，p-Akt明顯下調。與缺氧組比較，通心絡處理后的缺氧內皮細胞HIF-1α蛋白水平進一步顯著上調，Akt磷酸化水平明顯升高，見圖2。

4PI-3K/Akt信號通路對通心絡上調HIF-1α表達的影響

與對照質粒組比較，HUVECs細胞瞬時轉染Δp85后，再應用通心絡干預，HIF-1α蛋白被誘導的程度明顯受抑。瞬時轉染DN-Akt后，通心絡對HIF-1α蛋白表達的誘導程度同樣明顯減弱，見圖3。

5HIF-1α對通心絡改善細胞凋亡率的影響

與常規(guī)缺氧對照組比較，利用DN-HIF抑制HIF的表達后，缺氧內皮細胞的凋亡率顯著升高，利用通心絡處理后，其降低細胞凋亡率的程度較通心絡處理后的常規(guī)缺氧組明顯減弱，見表2。

圖1HIF表達下調后各組細胞活性的變化

圖2各組細胞HIF-1α及Akt磷酸化水平的變化

6通心絡對凋亡相關因子Bcl-2、Mcl-1和Bax表達的影響

免疫印跡檢測結果顯示，與對照組比較，缺氧組Bcl-2表達顯著下調，而Bax表達明顯上調。與缺氧組比較，通心絡處理后的缺氧內皮細胞Bcl-2和Mcl-1顯著上調，而Bax明顯下調，見圖4。

討 論

通心絡是近些年來在臨床上廣泛應用于治療心腦血管病的復方中藥[10]。大量的研究表明，在各種心腦血管病的發(fā)病過程中均伴有不同程度的缺氧過程。復方中藥通心絡能否緩解或對抗缺氧給血管內皮細胞帶來的損傷尚未見報道。在本研究中，我們探討了通心絡提高血管內皮細胞在缺氧條件下抗缺氧損傷能力的機制，研究結果證實，通心絡可依賴PI-3K/Akt/HIF依賴的信號通路上調血管內皮細胞中HIF的表達，進而提高血管內皮細胞抗缺氧損傷的能力。

HIF-1最先由Semenza等[11]在缺氧誘導的Hep3B細胞核提取物中發(fā)現，是一種DNA結合性蛋白質分子，能與EPO和VEGF基因的3′增強子序列結合，促進其轉錄，發(fā)揮血管保護作用，缺血缺氧時HIF-1的表達被認為是內源性保護機制的始動因子和共同途徑[12]。另有研究表明，HIF-1α能在缺氧的心肌組織內聚集并被激活，通過誘導血管生成和調節(jié)能量代謝等途徑，增強心肌細胞抵抗缺氧缺血損傷的能力[13]。在缺氧條件下，通心絡能否通過上調HIF 的表達提高血管內皮細胞抗缺氧損傷能力尚未見報道。本研究結果顯示，與常氧條件下比較，應用通心絡處理缺氧內皮細胞其增殖活性顯著升高，但較常氧條件下促細胞增殖的程度明顯減弱。進一步研究結果顯示，利用HIF的顯性負性突變體下調HIF 的表達后，缺氧內皮細胞的增殖活性進一步顯著下降，通心絡提高HUVEC增殖活性的程度隨之明顯降低，提示通心絡改善血管內皮細胞抗缺氧損傷能力的機制對HIF 的表達具有一定程度的依賴性。

圖3PI-3K/Akt信號通路對通心絡上調HIF-1α表達的影響

表2 HIF對缺氧內皮細胞凋亡百分率的影響

*P<0.05,**P<0.01vshypoxia group;△P<0.05,△△P<0.01vshypoxia+DN-HIF group.

圖4通心絡對缺氧內皮細胞凋亡相關分子Bcl-2、Mcl-1和Bax表達的影響

有研究報道，轉染具有持續(xù)活性的HIF-1α至腎內后，可保護腎臟對抗缺血所造成的損傷[14]。另有研究發(fā)現，激活并促進Akt磷酸化可導致細胞內發(fā)生變化，從而促進細胞存活[15]。通心絡能否進一步提高缺氧條件下HIF-1α及Akt磷酸化表達水平，進而提高內皮細胞對抗缺氧損傷能力尚未見報道。本研究結果顯示，與常氧對照組比較，缺氧組HIF-1α的表達呈現一定程度的升高，而磷酸化Akt則明顯下調。與缺氧組比較，通心絡處理后的缺氧內皮細胞HIF-1α蛋白水平表達進一步顯著上調，同時Akt磷酸化水平明顯升高。結合已有的研究報道，提示通心絡提高缺氧血管內皮細胞的存活率與HIF-1α及Akt磷酸化表達水平可能具有一定關系。

文獻報道，缺氧誘導因子HIF的活化還與PI-3K/Akt信號通路有關[16-17]，PI-3K/Akt信號通路可激活一系列生長信號通路，阻斷一系列凋亡信號通路[18]，從而促進細胞的增殖活性。PI-3K/Akt與HIF-1α之間關系非常密切[19]。Chen等[20]應用PI-3K抑制劑Ly294001抑制腎上皮細胞中PI-3K的活性后，HIF的表達明顯受到抑制。本研究發(fā)現利用Δp85和DN-Akt抑制PI-3K/Akt信號通路后，通心絡對HIF蛋白表達水平的上調作用被明顯抑制，提示通心絡對HIF表達的誘導作用在一定程度上是通過激活PI-3K/Akt信號通路實現的。

細胞凋亡可能是細胞缺氧導致損傷的主要原因之一[21]。通心絡能否通過抗凋亡作用實現對缺氧內皮細胞的保護也是本研究所要解決的主要問題。本研究結果顯示，與常氧對照組比較，缺氧組Bcl-2表達顯著下調，而Bax表達明顯上調。通心絡處理后的缺氧組細胞Bcl-2和Mcl-1被顯著誘導上調，而Bax顯著下調，流式細胞儀檢測結果進一步證實，與常氧對照組比較，缺氧內皮細胞其凋亡率顯著升高，應用通心絡處理后，其凋亡百分率明顯降低，進一步研究顯示，利用DN-HIF抑制HIF-1α的表達后，內皮細胞的凋亡率顯著升高，利用通心絡處理后，其降低細胞凋亡率的程度較通心絡處理后的常規(guī)缺氧組明顯減弱，綜合比較提示，通心絡對缺氧內皮細胞具有明顯的抗凋亡作用，而該作用對HIF-1α具有一定程度的依賴性。

綜上所述，在缺氧條件下，進一步上調HIF蛋白表達水平，促進抗凋亡因子同時抑制促凋亡因子的表達，提高缺氧細胞的增殖活性，降低細胞凋亡率可能是通心絡提高血管內皮細胞對抗缺氧損傷的分子機制之一，而通心絡對PI-3K/Akt通路的激活則是缺氧條件下其進一步上調HIF的信號轉導機制之一。值得一提的是，目前的研究證明： HIF-1活性至少在mRNA水平、蛋白質水平和HIF-1二聚化水平調節(jié)，其中最主要發(fā)生在蛋白質水平,即通過HIF-1α蛋白的羥化、乙?；⒘姿峄恼{節(jié)和信號轉導途徑來提高蛋白質的穩(wěn)定性和增強其轉錄活性[22]。通心絡能否通過上述環(huán)節(jié)發(fā)揮上調HIF作用而提高細胞耐缺氧能力，值得進一步研究。

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Tongxinluoimprovesanti-hypoxiaabilityofvascularendothelialcellsviaPI-3K/Akt/HIFpathway

LIANG Jun-qing1, XU Hai-bo2, CHEN Xiao-juan1, XING Zhi-jun2, YIN Bei-pei4, WU Kun3, ZHANG Zi-qian1, ZHOU Li-tao1, WU Yi-ling1

(1HebeiYilingPharmaceuticalResearchInstitute,Shijiazhuang050035,China；2AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;3InternationalCooperationLaboratoryonSignalTransduction,EasternHepatobiliarySurgeryHospitalAffiliatedtoSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China;4ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200040,China.E-mail:liangjunqing1234@163.com)

AIM: To investigate the effects of PI-3K/Akt/HIF pathway on anti-hypoxia ability of vascular endothelial cells influenced by Tongxinluo under hypoxic condition.METHODSHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were divided into the following groups: control group, Tongxinluo (100 mg/L) group, hypoxia group and hypoxia+Tongxinluo (100 mg/L) group. The CCK-8 assay were used to detect the viability and proliferation rate of the cells in each group. The protein levels of HIF-1α, Bcl-2, Mcl-1, Bax and phosphorylated Akt were studied by immunoblotting analysis. The HUVECs were transiently transfected with the dominant negative mutant of HIF-1α (DN-HIF). The apoptotic rates were analyzed by flow cytometry (FCM). The HUVECs were transiently transfected with the dominant negative mutant of PI-3K (Δp85) or Akt (DN-Akt) to investigate the role of PI-3K/Akt signal pathway in the anti-hypoxia ability of Tongxinluo on endothelial cells.RESULTSUnder hypoxic condition, although the proliferation rate increased significantly in Tongxinluo group compared with hypoxia group, the degree was notably weak compared with control group. The protein levels of HIF-1α, Bcl-2, Mcl-1 and phosphorylated Akt were up-regulated by Tongxinluo. Meanwhile, the expression of Bax was down-regulated. Inhibition of HIF-1α activation by DN-HIF and inhibition of the PI-3K/Akt pathway by Δp85 or DN-Akt attenuated the increase in HIF-1α expression and HUVEC viability induced by Tongxinluo. The percentage of apoptotic HUVECs was down-regulated to a certain extent by Tongxinluo.CONCLUSIONTongxinluo improves the anti-hypoxia ability of vascular endothelial cells by up-regulating the protein level of HIF-1α, promoting the expression of anti-apoptotic factors, improving the cell viability and eventually reducing the apoptotic rate.These effects of Tongxinluo depend on PI-3K/Akt signal pathway.

Tongxinluo; Hypoxia-inducible factor; Vascular endothelial cells; Signal transduction; Hypoxic injury

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.014