全仁夫, 湯樣華, 楊迪生, 黃忠名, 李 偉, 徐金渭, 吳曉春

(1蕭山區(qū)中醫(yī)院骨科，浙江 杭州 311200；2浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310009；3上海大學(xué)材料學(xué)院, 上海 200072)

1000-4718(2012)05-0777-08

2011-11-13

2012-02-09

浙江省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目(No.2007A170)；杭州市科技發(fā)展計劃項目(No.20080333B23)

△通訊作者 Tel: 0571-82727212；E-mail:quanrenf@263.net

HA/ZrO2不同復(fù)合材料對MSCs貼壁、增殖及成骨分化影響的差異*

全仁夫1△, 湯樣華1, 楊迪生2, 黃忠名1, 李 偉1, 徐金渭1, 吳曉春3

(1蕭山區(qū)中醫(yī)院骨科，浙江 杭州 311200；2浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310009；3上海大學(xué)材料學(xué)院, 上海 200072)

目的觀察間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在不同生物材料表面的生長及成骨分化情況。方法采用干鋪法制備氧化鋯(ZrO2)單層復(fù)合羥基磷灰石(HA)及ZrO2梯度復(fù)合HA 兩種復(fù)合材料，觀察復(fù)合材料表面形貌特征。分離和培養(yǎng)兔MSCs，分別培養(yǎng)于HA/ZrO2單層復(fù)合材料、HA/ZrO2梯度復(fù)合材料、純HA及ZrO2材料薄片上，觀察細(xì)胞貼壁、增殖情況和堿性磷酸酶活性，提取細(xì)胞總RNA并檢測Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果制備的HA/ZrO2單層復(fù)合材料具有不連續(xù)的HA表面層，可以清晰地觀察到部分ZrO2基體。而HA/ZrO2梯度復(fù)合材料表面較為粗糙，呈多孔狀。X射線衍射分析顯示，經(jīng)高溫?zé)Y(jié)后，兩種復(fù)合材料表面的ZrO2相依舊存在，HA相轉(zhuǎn)變?yōu)棣?Ca3(PO4)2(β-TCP)、α-Ca3(PO4)2(α-TCP)和CaZrO3相。細(xì)胞培養(yǎng)顯示，HA/ZrO2梯度復(fù)合材料更有利于細(xì)胞貼壁。細(xì)胞在純HA上堿性磷酸酶活性較其它組顯著升高；細(xì)胞在復(fù)合材料和純HA上Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白表達(dá)較對照組均有不同程度升高，其中Ⅰ型膠原表達(dá)升高更為明顯。結(jié)論HA/ZrO2梯度復(fù)合材料可促進(jìn)MSCs的增殖，并可促進(jìn)MSCs的成骨分化。

氧化鋯； 羥基磷灰石類； 間充質(zhì)干細(xì)胞

在組織工程骨構(gòu)建過程中，通常將種子細(xì)胞種植到支架材料表面以達(dá)到更好地修復(fù)骨缺損。細(xì)胞與支架共培養(yǎng)過程中，細(xì)胞將在支架表面增殖及分化。羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)由于其良好的生物相容性及骨傳導(dǎo)性而被用做組織工程骨的支架材料[1]。而以支架材料復(fù)合種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨較傳統(tǒng)的填充材料在修復(fù)程度、修復(fù)速度、新生骨形態(tài)等方面具有更多的優(yōu)越性[2]。我們之前研制了一種新型的支架材料——HA/氧化鋯(zirconium oxide,ZrO2)復(fù)合材料，現(xiàn)擬探究此種復(fù)合材料對目前常用的種子細(xì)胞——間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的生長增殖及成骨分化的影響。為此新型復(fù)合支架材料的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)，為該復(fù)合支架的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1動物

健康新西蘭兔，6月齡新西蘭兔30只，雌雄不分，體重約2.5～3.0 kg。浙江大學(xué)實驗動物中心提供。

2主要試劑

淋巴細(xì)胞分層液購自上海生化試劑廠；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清DMEM培養(yǎng)液購自杭州四季青生物公司；PrimeScript RT reagent kit試劑盒購自TaKaRa；MTT試劑盒購自碧云天公司；Giemsa染液購自上海生化試劑公司。

3方法

3.1HA/ZrO2復(fù)合材料的制備 HA/ZrO2復(fù)合材料分為ZrO2單層復(fù)合HA(以下簡稱單層復(fù)合)和ZrO2梯度復(fù)合HA(以下簡稱梯度復(fù)合)2種，使用干鋪法制備。單層復(fù)合生物材料的制備方法：在鋼模中先鋪上一層HA料粉，再鋪上ZrO2料粉，最后在ZrO2料粉表面再對稱平鋪一層HA料粉。梯度復(fù)合生物材料的制備方法：在ZrO2基體上下表面由表及里分別對稱平鋪上按不同比例的納米HA粉體與納米ZrO2粉體混合而成的粉料(表1)，形成純HA到HA+ZrO2逐層過渡，再到ZrO2基體的梯度過渡層。將料粉按不同規(guī)格在鋼模中逐層平鋪好后，使用液壓式萬能力學(xué)測試實驗機(jī)，在設(shè)定的成型壓力單向干壓，形成素坯。將素坯放在剛玉坩堝中，置于立式硅鉬棒爐內(nèi)，1 600 ℃無壓燒結(jié)3 h，隨后對燒結(jié)體采用慢冷的方式冷卻，即讓其在爐內(nèi)自然冷卻后取出。

3.2性能測試 應(yīng)用D/max-2550 X射線衍射儀分析粉體以及復(fù)合材料的相組成。用HITACHI S-570掃描電子顯微鏡(scaning electron microscope,SEM)觀察了復(fù)合材料表面及其斷口截面的形貌。

表1HA/ZrO2復(fù)合材料不同比例粉體的配方設(shè)計

Table 1. The recipe formulation of the different proportion of the composite particles

FormulaZrO2(weight%)HA(weight%)1010023070350504703051000

用EDAX能譜儀對梯度復(fù)合材料截面的Zr、Ca兩元素沿復(fù)合層厚度方向上的分布做了線掃描分析。彎曲強(qiáng)度采用濟(jì)南試驗機(jī)廠制造的WDW-100A電子式萬能試驗機(jī)測得(根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 6569-86，加載速度為0.5 mm/min，跨距為30 mm)。復(fù)合材料的表面粗糙度使用FTSS4c觸針式表面粗糙度輪廓測量儀測試(根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 10610-1998，高頻濾波，λc/λs=300/1)。

3.3MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 新西蘭兔經(jīng)3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg 麻醉后，以8%硫化鈉去除脛骨近端被毛。術(shù)野經(jīng)碘伏及75%乙醇消毒后，以骨髓穿刺針從脛骨結(jié)節(jié)外側(cè)穿刺，穿刺針旋轉(zhuǎn)刺入髓腔，接5 mL注射器(注射器內(nèi)預(yù)留肝素鈉2 000 U)，抽取骨髓液3～4 mL。吸出的骨髓液緩慢注入預(yù)先加入4 mL淋巴細(xì)胞分層液的試管內(nèi),密度梯度離心,2 500 r/min離心30 min, 離心后吸取中間的單個核細(xì)胞層，PBS洗1次，以3×105/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，加15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液3 mL(含青霉素鈉1×105U/L，鏈霉素100 g/L，pH 7.2～7.4)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)。3～5 d后半量換液。繼續(xù)培養(yǎng)且全量每周換液2次。待細(xì)胞長滿底面后, 用0.25%胰酶消化5 min，即得到原代MSCs懸液，再以1×104/cm2的密度傳代培養(yǎng)。

3.3.1繪制細(xì)胞生長曲線圖 從第1 d起，取貼壁細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，每天各取3孔計數(shù),每孔計數(shù)3次，計算均值，連續(xù)6 d，描繪生長曲線。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀況。

3.3.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定 取培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶和1 mmol/L EDTA消化后，加入含1%小牛血清的PBS,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×1010/L，分別加入小鼠抗大鼠CD45-PE、CD54-PE和CD90-FITC單克隆抗體， 4 ℃孵育30 min，PBS清洗后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定。

3.4細(xì)胞培養(yǎng) 將滅菌的、直徑為20 mm的HA/ZrO2復(fù)合材料置于內(nèi)徑為21 mm的12孔板中。以普通孔板底面為對照。以5×103/cm2的密度將MSCs分別種植在HA/ZrO2單層復(fù)合、HA/ZrO2梯度復(fù)合、純HA與純ZrO2材料上，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10 mmol/L β-磷酸甘油、50 g/L α-維生素C和100 nmol/L地塞米松)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。每3 d更換培養(yǎng)液。

3.5細(xì)胞貼壁和增殖評定

3.5.1細(xì)胞貼壁率的定量評定 于培養(yǎng)6、12和24 h后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞樣本，以1 mmol/L EDTA和0.25%胰酶解離細(xì)胞。以血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。細(xì)胞貼壁率以貼壁細(xì)胞數(shù)量占初始種植細(xì)胞數(shù)量的百分比表示。

3.5.2細(xì)胞增殖評定(MTT 法) 細(xì)胞培養(yǎng)1、3、5、7 d后分別行MTT檢測。每孔加入MTT(5 g/L)100 μL，培養(yǎng)3 h，棄上清，加入200 μL DMSO，振蕩12 min，取上清200 μL至96孔板，酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm的吸光度(A)值。

3.6堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性測定 將待檢樣本每孔加入2%Triton X-100 400 μL于 4 ℃冰箱過夜以裂解細(xì)胞。取細(xì)胞裂解液與無色對硝基苯基磷酸鈉反應(yīng)，生成黃色對硝基苯酚，于405 nm處測定吸光度(A)值，并與標(biāo)準(zhǔn)比對計算酚生成量。以酚生成量(mg)與相應(yīng)總蛋白含量之比定義ALP活性。測定重復(fù)4次。

3.7總RNA提取及RT-PCR 細(xì)胞樣本經(jīng)PBS清洗3遍，吸盡PBS。加1 mL Trizol，吹打均勻，室溫放置5 min。加入0.2 mL氯仿/mL Trizol，振蕩15 s，室溫放置8 min。后4 ℃、12 000×g離心15 min。吸取上層水相，加入0.5 mL異丙醇/mL Trizol，室溫放置20 min。于4 ℃、12 000×g離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇/mL Trizol， 4 ℃、8 000×g離心5 min，吸盡上清乙醇，室溫敞口干燥10 min， RNase-free水20 μL重溶，于核酸蛋白定量儀測定A值。RT-PCR反應(yīng)體系配方: 2～5 μL cDNA,1 μL引物A(10 μmol/L),1 μL引物B(10 μmol/L)，2.5 μL 10×PCR buffer，3 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.25 μL 5 U/μL Taq Plus Ⅰ(DNA聚合酶)及適量滅菌水使反應(yīng)體系總體積為25 μL。引物序列見表2。PCR儀設(shè)置條件：94 ℃ 2 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30～35個循環(huán)，4 ℃ 暫停1 h。電泳后以Image-Pro Plus軟件分析條帶面積及灰度，并計算二者乘積以IA表示。

3.8ELISA法檢測成骨標(biāo)志蛋白 裂解液中成骨標(biāo)志蛋白I型膠原(collagen I)、骨鈣蛋白(osteocalcin)和骨橋蛋白(osteopontin)含量使用ELISA方法檢測(RapidBio Lab)。檢測方法參照說明書。將100μL細(xì)胞裂解液加入抗I型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白抗體分別包被的96孔板中，并在室溫下孵育1 h。在用PBS充分沖洗后，將100 μL基質(zhì)液加入孔板，并在室溫條件下孵育15 min。隨后，加入100 μL酸性終止液。在450 nm下測量A值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。各種標(biāo)志蛋白含量用總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化。實驗重復(fù)4次。

表2 RT-PCR引物序列

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1復(fù)合材料的SEM分析

圖1顯示HA/ZrO2單層復(fù)合材料具有不同的表面形貌，圖1A為不連續(xù)的HA表面層，可以清晰地觀察到部分ZrO2基體；而圖1B中的HA表面層幾乎連續(xù)地覆蓋在ZrO2基體上。從圖1可見，復(fù)合材料的表面較為粗糙，而粗糙的表面有利于其在生物體內(nèi)與周圍組織的結(jié)合，能為新生的生物組織長入提供有利條件[2]，從而提高復(fù)合材料的生物相容性。

HA/ZrO2梯度復(fù)合材料的表面見圖2。HA/ZrO2梯度復(fù)合材料的表面較為粗糙，且表面是多孔狀的，分布著大小為2～25 μm的孔洞?？锥瓷顪\不一，呈連通狀。

Figure 1. Scaning electron micographs of the surface of HA/ZrO2monolayer composite(×1 000).A：discontinuous HA surface;B：continuous HA surface.

圖1HA.ZrO2單層復(fù)合材料表面掃描電鏡照片

Figure 2. Scaning electron micographs of the surface of HA/ZrO2gradient composite (A：×300;B：×1 500).

圖2HA/ZrO2梯度復(fù)合材料表面掃描電鏡照片

圖3為HA/ZrO2梯度復(fù)合材料斷口截面的SEM結(jié)果。圖3A顯示，表面層的厚度大約100 μm，并且較好地附著在基體上，芯部基體組織與表面層均勻過渡結(jié)合，沒有明顯界面，相互之間是冶金結(jié)合。圖3B顯示線掃描結(jié)果，受斷口表面結(jié)構(gòu)高低起伏的影響，Zr、Ca元素含量的線分布起伏較大。但仍可見在基體部分，Zr元素維持在相對穩(wěn)定的值，而過渡到表

面層后，Zr元素減少到基線。相反，基體部分的Ca元素維持在基線，而到表面層后，Ca元素突然增加到了一個穩(wěn)定的高值。由此判斷，斷口的芯部基體組織為ZrO2，不含有HA；而斷口表面層組織為HA，不含有ZrO2。

圖3C、D分別為斷口基體和表面層的放大SEM照片。由斷口基體的照片觀察發(fā)現(xiàn)斷口基體較為粗糙，呈現(xiàn)出明顯的凹凸不平狀，多為沿晶斷裂，韌性斷裂，表示基體材料的致密度較高，韌性佳?；w材料ZrO2晶粒較細(xì)小、均勻，由于ZrO2獨特的增韌機(jī)制，使得復(fù)合材料基體部分表現(xiàn)出良好的機(jī)械性能。而組織為HA的斷口表面較為平整，斷面上氣孔分布少，HA層晶粒粗大，斷口為脆性斷裂，表示HA表面層為脆性材料，強(qiáng)度低，力學(xué)性能較差。在高韌性的ZrO2基體表面復(fù)合HA，能夠?qū)⒒w材料優(yōu)良的力學(xué)性能和HA的生物活性相結(jié)合，提高其綜合性能。

Figure 3. Scaning electron micrographs of the fracture surface of HA/ZrO2gradient composite.A： fractured composite(×200); B：line scaning of Zr and Ca in A; C： base of the fracture section(×2 000); D： surface of the fracture section(×1 000).

圖3HA/ZrO2梯度復(fù)合材料斷口的掃描電鏡照片

2復(fù)合材料的表面粗糙度測試

成骨細(xì)胞的附著和增殖能力隨著表面粗糙度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)表面粗糙度大時(Ra>1.5 μm時)，有利于成骨細(xì)胞的附著和增殖。本次測試結(jié)果表明，單層復(fù)合材料的表面粗糙度為3.12 μm，梯度復(fù)合材料的表面粗糙度為1.95 μm。該粗糙度對于成骨細(xì)胞的長入是有利的[3]。

3復(fù)合材料的X射線衍射(X-raydiffraction,XRD)分析

通過復(fù)合材料表面的XRD可以觀測到，在1 600 ℃燒結(jié)后，復(fù)合材料表面的ZrO2相依舊存在，而HA相消失。HA相轉(zhuǎn)變?yōu)棣?Ca3(PO4)2(β-TCP)、α-Ca3(PO4)2(α-TCP)和CaZrO3相,見圖4。這是因為在HA轉(zhuǎn)變?yōu)棣?TCP的過程中，釋放出了CaO。在復(fù)合材料表面的XRD中并未發(fā)現(xiàn)CaO，這是由于CaO完全溶解于ZrO2，并在ZrO2相中穩(wěn)定，兩者相互反應(yīng)生成 CaZrO3。復(fù)合材料燒結(jié)后，β-TCP相的出現(xiàn)是由于六方晶型的HA結(jié)構(gòu)增強(qiáng)效應(yīng)的結(jié)果。少量α-TCP相則是由β-TCP轉(zhuǎn)變而來的。

上述反應(yīng)可以用如下反應(yīng)式來表達(dá)：Ca10(PO4)6(OH)2?3β-Ca3(PO4)2+CaO+H2O；CaO+ZrO2?CaZrO3；β-Ca3(PO4)2?α-Ca3(PO4)2。

與純HA相比，β-TCP在人體液中具有更好的溶解性、良好的生物降解性、生物相容性和骨引導(dǎo)能力，已經(jīng)應(yīng)用于骨組織修復(fù)。

Figure 4. The XRD pattern of the surface of an HA/ZrO2composite sintered at 1 600 ℃. Z: ZrO2; CZ: CaZrO3; α: α-Ca3(PO4)2; β: β-Ca3(PO4)2.

圖41600℃燒結(jié)后復(fù)合材料表面的XRD圖

為了更好地定性界面上是否有新的物質(zhì)產(chǎn)生，將剝落后的試樣界面進(jìn)行XRD測試，如圖5所示，黑色線是典型的HA分解產(chǎn)物的曲線，而燒結(jié)后的界面(紅色線)明顯改變，對比標(biāo)準(zhǔn)卡片，在30.0°、34.7°、50.0°和59.4°處出現(xiàn)了CaZrO3的峰。另外，對比可以發(fā)現(xiàn)，TCP峰明顯減少，并且峰強(qiáng)明顯減弱，說明在界面處TCP的含量較少。

4復(fù)合材料的力學(xué)性能

表3中單層復(fù)合和梯度復(fù)合兩種復(fù)合材料的平

均抗彎強(qiáng)度分別為732.85 MPa與689.04 MPa。該值明顯高于純HA的50～150 MPa，也高于傳統(tǒng)的ZrO2和HA粉體混料燒結(jié)制備的復(fù)合材料[4]?？梢?，以ZrO2和HA相復(fù)合的方法，制備的材料能使HA增強(qiáng)，有望滿足人體承重部位的人工種植體的力學(xué)要求。

Figure 5. The XRD pattern of the spalling interface of a sample. CZ: CaZrO3; the rest are Ca3(PO4)2.

圖5剝落后試樣界面的XRD圖

表3復(fù)合材料的抗彎強(qiáng)度

SampleBendingstrength(MPa)HA-ZrO2732.85±116.70HA-70%HA-50%HA-30%HA-ZrO2689.04±131.20*

*P<0.05vsHA-ZrO2.

5MSCs的原代培養(yǎng)形態(tài)、生長曲線及鑒定

將用密度梯度法分離的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，鏡下可見大量懸浮的細(xì)胞，接種24 h后便有少量的細(xì)胞貼壁, 多為梭形或成纖維細(xì)胞樣，經(jīng)換液后，非貼壁細(xì)胞逐漸減少，貼壁細(xì)胞逐漸呈克隆樣生長，約10 d后，細(xì)胞逐漸融合，呈放射樣、爆花樣或漩渦樣。細(xì)胞長滿瓶底約需10～15 d。傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長穩(wěn)定,約3～4 d傳代1次，可傳20代以上，見圖6。MSCs以1×104/cm2接種時4 d可長滿瓶底，傳1代細(xì)胞可擴(kuò)增4倍。增殖倍增時間約為24 h,見圖7。

Figure 6. The morphosis of primarily cultured MSCs (×300). A: the colony-like MSCs; B: the blasting-like cells; C: the vortex-like cells.

圖6MSCs原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)

圖7MSCs生長曲線

根據(jù)國際細(xì)胞治療協(xié)會(International Society for Cellular Therapy，ISCT) 對MSCs的定義，認(rèn)為MSCs是貼壁生長，表達(dá)特定表面抗原，并具有間充質(zhì)分化潛能。如圖8所示，經(jīng)誘導(dǎo)后出現(xiàn)成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞表型，高表達(dá)CD90(98.60%)和CD44(63.14%)，低表達(dá)CD45(0.96)和CD31(1.65%)，符合ISCT給出的標(biāo)準(zhǔn)。

6細(xì)胞貼壁和增殖

如圖9 所示，在12 h和24 h時，HA/ZrO2梯度復(fù)合材料上的細(xì)胞貼壁率顯著高于其它材料組(P<0.05)。HA/ZrO2單層復(fù)合材料組各時點的細(xì)胞貼壁率均高于純HA和純ZrO2組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這些數(shù)據(jù)說明HA/ZrO2梯度復(fù)合材料更有利于細(xì)胞貼壁。

如圖10所示，在1 d和9 d時細(xì)胞在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料上的數(shù)量均顯著高于其它材料組。盡管在5 d時不存在顯著差異，但梯度復(fù)合材料組的細(xì)胞數(shù)量均值仍高于其它材料組。這些數(shù)據(jù)說明HA/ZrO2梯度復(fù)合材料更有利于細(xì)胞增殖。

7MSCs在復(fù)合材料上的成骨分化

7.1ALP活性 如圖11所示，純HA薄片上細(xì)胞ALP活性顯著升高。梯度復(fù)合和單層復(fù)合薄片上細(xì)胞ALP活性略有升高，但差異不顯著；純ZrO2與對照組比較差異無顯著。

7.2I型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白mRNA和蛋白表達(dá) 由圖12、13可知，在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，細(xì)胞4種基質(zhì)上都有I型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白表達(dá)。復(fù)合材料和純HA組Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白表達(dá)較對照組(常規(guī)培養(yǎng)基質(zhì)上)均有不同程度升高，其中Ⅰ型膠原表達(dá)升高更為明顯。純ZrO2組Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白表達(dá)較對照組稍有降低，骨橋蛋白表達(dá)升高程度與復(fù)合材料和純HA組差異不大。這進(jìn)一步說明復(fù)合材料基質(zhì)有利于促進(jìn)MSCs成骨分化。

Figure 8. Identification of MSCs. A, B: alkaline phosphatase (ALP, an osteogenetic marker) staining; C, D: von Kossa staining (showing mineral deposition); E, F: Sudan III staining (showing fat deposition); A, C, E: before induction; B, D, F: after induction; G: surface CD molecules of MSCs detected by flow cytometry. Scale bars in A～F present 50 μm.

圖8MSCs的鑒定

圖9MSCs在4種材料薄片上的貼壁率

圖10MSCs在4種材料薄片上的增殖

圖11MSCs在4種材料薄片上的堿性磷酸酶活性

討 論

種子細(xì)胞與支架材料的相互作用是骨組織工程研究的重要領(lǐng)域, 作為支架材料的組織工程材料不但須具有一定的親水性和粗糙度，有利于細(xì)胞的黏附、貼壁，而且還須提供細(xì)胞生長基質(zhì)如多孔的表面形貌等，這樣才能進(jìn)行細(xì)胞遷徙、分化和增殖。其次，作為種子細(xì)胞本身也必須具有黏附、 分化和增殖的特性。因而要具備以上2種特性才能應(yīng)用于臨床，其中骨種子細(xì)胞與支架材料的黏附是研究的基礎(chǔ)。本實驗以常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)為對照，來探索MSCs在HA/ZrO2不同的復(fù)合材料基質(zhì)表面的貼壁、增殖及成骨分化。

HA/ZrO2復(fù)合材料具有一定的親水性和粗糙度，電鏡下HA/ZrO2梯度復(fù)合材料表面有多孔形貌，均勻分布著2～25 um的小孔，已研究證實復(fù)合材料的微孔結(jié)構(gòu)有利于MSCs觸角深入到其表面的微孔[5]。

Figure 12. Collagen I, osteocalcin and osteopontin mRNA expression in MSCs on the four materials.

圖12MSCs在4種材料薄片上I型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白mRNA的表達(dá)

圖13MSCs在4種材料薄片上I型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)

因此，HA/ZrO2復(fù)合材料有利于MSCs細(xì)胞貼壁和增殖，其中以梯度復(fù)合材料更為顯著。HA/ZrO2復(fù)合材料成分的XRD檢測結(jié)果表明，經(jīng)1 600 ℃燒結(jié)后HA相已全部消失，生成了新相β-TCP、α-TCP和CaZrO3；當(dāng)未水合的高溫磷酸鹽(TCP相)與水、體液接觸后，在37 ℃下形成HA，并分解出Ca2+和HPO42-沉積于陶瓷基體表面，經(jīng)過一段時間的接觸，陶瓷基體成分發(fā)生了微小的變化，β-TCP相減少，HA相增多， HA可吸附血清蛋白等大分子物質(zhì)，有利于吸附血清蛋白，更有利于細(xì)胞貼壁[6]。與純HA相比，HA的分解產(chǎn)物β-TCP具有更好的溶解性、生物降解性和生物相容性以及骨引導(dǎo)能力，可提供良好的細(xì)胞黏附生長環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。因此，在HA/ZrO2復(fù)合材料上，MSCs的增殖率增高說明該材料表面的這些特征或成分促進(jìn)了MSCs的增殖。此外，也可歸因于平滑的基質(zhì)表面。有文獻(xiàn)顯示平滑表面較粗糙表面更有利于細(xì)胞貼壁及增殖[9]。相對于粗糙表面，細(xì)胞附著于平滑表面具有更大的黏著斑，這確保了細(xì)胞與基質(zhì)間的牢固結(jié)合，也是細(xì)胞黏著增強(qiáng)的原因之一。有很多研究表明，生長基質(zhì)表面粗糙程度會對細(xì)胞增殖速率構(gòu)成影響[9,11]，成骨細(xì)胞在納米相陶瓷上也出現(xiàn)貼壁增強(qiáng)[10]。因此，我們推測貼壁依賴性細(xì)胞都會出現(xiàn)在HA/ZrO2復(fù)合材料上貼壁增強(qiáng)的現(xiàn)象，貼壁增強(qiáng)是另一個導(dǎo)致增殖速率增強(qiáng)的原因。另外，基質(zhì)表面粗糙程度會影響細(xì)胞基因表達(dá)，從而影響增殖速率[12-13]。

前面已經(jīng)提及I型膠原、ALP、骨鈣蛋白和骨橋蛋白是常用的評價MSCs成骨分化的指標(biāo)[14]。未分化的MSCs可少量表達(dá)I型膠原，但不表達(dá)ALP、骨鈣蛋白和骨橋蛋白。發(fā)生成骨分化后I型膠原表達(dá)加強(qiáng)，細(xì)胞同時可表達(dá)ALP、骨鈣蛋白和骨橋蛋白。本實驗結(jié)果顯示在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中MSCs在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)表面的ALP、I型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白表達(dá)均增強(qiáng)。說明HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)可促進(jìn)MSCs的成骨分化。I型膠原是骨組織的有機(jī)成分。MSCs在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)上的I型膠原表達(dá)增強(qiáng)意味著在以HA/ZrO2梯度復(fù)合材料為支架材料時種植在上面的種子細(xì)胞MSCs可產(chǎn)生更多的骨組織的有機(jī)成分。顯然這將非常有利于損傷骨組織的修復(fù)。此外，骨鈣蛋白的主要功能之一是參與損傷組織的修復(fù)[15]。在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)上的高表達(dá)同樣更有利于損傷骨組織的修復(fù)。骨鈣蛋白的生理功能尚不完全清楚，但由于它只在骨組織中特異性表達(dá)，因而許多文獻(xiàn)將其作為成骨細(xì)胞的標(biāo)志[16]。骨鈣蛋白在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)上的高表達(dá)可能意味著更多的MSCs可分化為成骨樣細(xì)胞。ALP是成骨細(xì)胞的主要功能酶，它與骨組織的礦化密切相關(guān)。由于技術(shù)上的原因，本研究未評價MSCs在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)上的礦化情況。但根據(jù)前一部分?jǐn)?shù)據(jù)推測，MSCs可能在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)上的礦化程度減弱。ALP的表達(dá)增強(qiáng)可能并不能增強(qiáng)MSCs的礦化。但由于HA本身就是骨組織的主要無機(jī)成分，以HA/ZrO2梯度復(fù)合材料為支架材料時MSCs礦化的減弱并不會影響新生骨組織的礦化程度。

修復(fù)骨缺損的生物陶瓷材料的生物相容性極其重要。我們的研究顯示，與HA/ZrO2單層復(fù)合材料、純HA和ZrO2基質(zhì)相比，HA/ZrO2梯度復(fù)合材料基質(zhì)更適于MSCs的貼壁和增殖。在組織工程骨的構(gòu)建中，用HA/ZrO2梯度復(fù)合材料作為支架材料，有望獲得更為優(yōu)良的成骨性能。

[1] Cai YR, Liu YK, Yan WQ, et al. Role of hydroxyapatite nanoparticle size in bone cell proliferation[J]. J Mater Chem, 2007, 17(36): 3780-3787.

[2] Zhou GS, Su ZY, Cai YR, et al. Different effects of nanophase and conventional hydroxyapatite thin films on attachment, proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. Biomed Mater Eng, 2007, 17(6): 387-395.

[3] Hayami JW, Waldman SD, Amsden BG. A photocurable hydrogel/elastomer composite scaffold with bi-continuous morphology for cell encapsulation[J]. Macromol Biosci, 2011, 11(12): 1672-1683.

[4] 黃傳勇，孫淑珍，張中太.生物陶瓷復(fù)合材料的研究[J].中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報，2000，19(3)：281-287.

[5] 楊 成，李源瑩，吳曉玲，等.微弧氧化陶瓷膜表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性實驗[J].生物骨科材料與臨床研究，2008，5(1)：12-14，18.

[6] Santos O, Kosoric J, Hector MP, et al. Adsorption behavior of statherin and a statherin peptide onto hydroxyapatite and silica surfaces byinsituellipsometry[J]. J Colloid Interface Sci, 2008, 318(2): 175-182.

[7] 焦 強(qiáng)，衛(wèi)小春，陸向東，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1和血清對人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響[J]. 中華創(chuàng)傷骨科雜志，2005，7(10)：960-963.

[8] 郭希民，王常勇，薄 斌，等.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物陶瓷構(gòu)建組織工程化人工軟骨[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2003，17(2)：147-151.

[9] Rosa AL, Beloti MM. Effect of cpTi surface roughness on human bone marrow cell attachment, proliferation, and differentiation [J]. Braz Dent J, 2003, 14(1): 16-21.

[10]Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, et al. Enhanced functions of osteoblasts on nanophase ceramics[J]. Biomaterials, 2000, 21 (17): 1803-1810.

[11]Baharloo B, Textor M, Brunette DM. Substratum roughness alters the growth, area, and focal adhesions of epithelial cells, and their proximity to titanium surfaces [J]. J Biomed Mater Res A, 2005, 74(1): 12-22.

[12]Brett PM, Harle J, Salih V, et al. Roughness response genes in osteoblasts[J].Bone, 2004, 35(1): 124-133.

[13]全仁夫，湯樣華，楊迪生，等.HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒的體外基因毒性的初步研究[J].中國病理生理雜志，2011，27(1)：175-178.

[14]Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in biodegradable sponges composed of gelatin and β-tricalcium phosphate[J].Biomaterials,2005,26(17): 3587-3596.

[15]Myers DL, Harmon KJ, Lindner V, et al. Alterations of arterial physiology in osteopontin-null mice[J]. Athroscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23(6):1021-1028.

[16]Weiβenb?ck M, Stein E, Undt G, et al. Particle size of hydroxyapatite granules calcified from red algae affects the osteogenic potential of human mesenchymal stem cellsinvitro[J]. Cells Tissues Organs, 2006 ,182(2): 79-88.

EffectsofdifferentHA/ZrO2compositesonadherence,proliferationandosteogenesisofculturedMSCs

QUAN Ren-fu1, TANG Yang-hua1, YANG Di-sheng2, HUANG Zhong-ming1, LI Wei1, XU Jin-wei1, WU Xiao-chun3

(1DepartmentofOrthopedics,TCMHospitalofXiaoshanDistrict,Hangzhou311200,China;2DepartmentofOrthopedics,theSecondAffiliatedHospitalofZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China;3MaterialCollegeofShanghaiUniversity,Shanghai200072,China.E-mail:quanrenf@263.net)

AIM: To study the adherence, proliferation and osteogenesis effects of different composites on cultured mesenchymal stem cells (MSCs).METHODSZirconium oxide (ZrO2) with monolayer hydroxyapatite (HA) composite and ZrO2with gradient HA composite were prepared using dry-laying method. The surface topography of the composites was observed. The rabbit MSCs were isolated and cultured on HA/ZrO2monolayer composite, HA/ZrO2gradient composite, pure HA or pure ZrO2slices. The adherence, proliferation and osteogenesis of the MSCs were assayed. The activity of alkaline phosphatase was detected. The mRNA expression of collagen I, osteocalcin and osteopontin was determined by RT-PCR.RESULTSThe discontinuous or continuous HA surface was observed in HA/ZrO2monolayer composite,while the surface of prepared HA/ZrO2gradient composite was fairly rough with porosity. The X-ray diffraction analysis shows that after megatemperature sintering, the ZrO2phase on the surface of the composite still remained, while the HA phase transformed to β-Ca3(PO4)2(β-TCP), α-Ca3(PO4)2(α-TCP) and CaZrO3phases. Cell culture showed that the HA/ZrO2gradient composite was in favour of cell adherence. The alkaline phosphatase activity in MSCs on pure HA slice was significantly increased compared compared with other groups.The mRNA expression of collagen I, osteocalcin and osteopontin in MSCs on HA/ZrO2composites and pure HA silice was higher than that in control group,especially the expression of collagen I.CONCLUSIONThe HA/ZrO2garded composite promotes the proliferation of MSCs to a certain extent, and also promotes the osteogenesis differentiation of MSCs.

Zirconium oxide; Hydroxyapatites; Mesenchymal stem cells

R318

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.002