汪 甜， 楊 麗， 張榮華

(暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)05-0769-08

2012-02-06

2012-04-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81173619);暨南大學(xué)藥學(xué)院211工程和重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新研究項(xiàng)目

△通訊作者 Tel: 020-85220023 ; E-mail: tzrh@jnu.edu.cn

·論著·

柚皮苷在促大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化過程中對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響*

汪 甜， 楊 麗， 張榮華△

(暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

目的研究中藥單體柚皮苷(NG)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向成骨細(xì)胞分化過程中MAPK信號(hào)通路的影響。方法觀察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制劑SB203580、PD98059、SP600125及3種抑制劑全部加入的情況下，各組堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、I型膠原(Col I)等骨向分化指標(biāo)的差異。用Western blotting技術(shù)檢測各組p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平，用熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、骨形成蛋白2(BMP-2)和核心結(jié)合因子α1(Cbfα1) mRNA的表達(dá)。結(jié)果(1)10-7mol/L為本實(shí)驗(yàn)中NG的最佳促骨向分化濃度。(2) NG最佳濃度組的ALP和BGP含量比其它各組都高(P<0.05)，Col I含量無明顯差異(P>0.05)；與NG組相比，加入不同抑制劑組的ALP、BGP和ColⅠ表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的降低。(3)與空白組相比，NG組JNK蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05)，p38蛋白的磷酸化水平降低(P<0.01)，ERK1/2蛋白的磷酸化水平無明顯差異(P>0.05)。與NG組相比，加入不同抑制劑組的p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平有升高也有降低。(4) NG組上調(diào)BMP-2的表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)Cbfα1的表達(dá)(P<0.05)，而對(duì)TGF-β1的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。與NG組相比，加入不同抑制劑組的TGF-β1、BMP-2和Cbfα1 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的降低。結(jié)論NG主要通過激活MAPK信號(hào)通路中ERK通路、JNK通路以及上調(diào)BMP-2的表達(dá)，促進(jìn)MSCs的骨向分化。NG上調(diào)BMP-2的表達(dá)受MAPK通路中p38通路的影響較大。

柚皮苷； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 骨向分化； MAPK信號(hào)通路

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種起源于中胚層、具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞。MSCs向成骨細(xì)胞(osteoblast, OB)分化的特性可為骨生長及骨修復(fù)提供細(xì)胞來源，在骨性疾病的治療上擁有非常良好的應(yīng)用前景。MSCs向OB分化是個(gè)復(fù)雜的過程,涉及多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中與絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)系密切。已有研究表明，MAPK通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated protein kinase, ERK)、p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路參與了OB分化增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在應(yīng)激、凋亡及骨質(zhì)代謝、炎癥中發(fā)揮重要作用[1]。

柚皮苷(naringin, NG)作為中藥骨碎補(bǔ)主要成分之一，大量存在于柚、葡萄柚和酸橙及其變種的果皮及果實(shí)中。NG具有促進(jìn)OB增殖和分化、抗過敏、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血脂、抑癌等多種藥理活性[2]。在促進(jìn)MSCs骨向分化方面雖然已有文獻(xiàn)進(jìn)行了初步研究[3]，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用中藥單體NG對(duì)SD大鼠MSCs進(jìn)行干預(yù)，觀察在NG促M(fèi)SCs骨向分化過程中ERK、p38和JNK通路的作用及與骨轉(zhuǎn)化調(diào)控因子之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

清潔級(jí)(SPF)Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌性，3月齡，體重 200 g左右，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2006-0015。

2主要儀器和試劑

倒置相差顯微鏡(Olympus)；CO2培養(yǎng)箱(Revco)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；數(shù)碼照相機(jī)(Canon)；掃描電子顯微鏡(Philips)；PCR儀、穩(wěn)壓恒流電泳儀、IQ5 Real Time PCR Detection System(Bio-Rad)。

α-MEM(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶、Triton X-100(Amresco)；噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO、pNPP(Sigma)；SB203580(SB，p38通路抑制劑)、PD98059(PD，ERK通路抑制劑)、SP600125(SP，JNK通路抑制劑)購自碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；大鼠骨鈣素(bone gla protein,BGP)ELISA檢測試劑盒、大鼠膠原酶Ⅰ(collagenase Ⅰ, Col I)ELISA檢測試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)測定試劑盒購自南京建成生物研究所；兔多克?、窨?Cell Signaling)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(Cell Signaling)，Trizol(Invitrogen)；氯仿、異丙醇(廣州化學(xué)試劑廠)；Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶購自大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工合成；柚皮苷購自中國藥品生物制品檢定所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

制備NG母液并設(shè)置不同濃度梯度[4-7]。取10 mg NG溶于85 μL DMSO溶液中配制成0.2 mol/L母液。用α-MEM完全培養(yǎng)基稀釋母液，分別得到濃度為1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L和1×10-9mol/L的NG溶液。

3方法

3.1原代MSCs的分離提取與鑒定 全骨髓貼壁法提取大鼠MSCs。3月齡SD雌性大鼠，頸椎脫臼法處死，置75%乙醇中浸泡10 min。無菌條件下迅速分離出雙側(cè)股骨，剔凈股骨上附著的脂肪結(jié)締組織和骨膜，迅速移入超凈臺(tái)。將分離好的股骨放入75%乙醇中浸泡30 s，隨后用D-Hanks緩沖鹽溶液沖洗4～5次， 放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，剪去股骨兩頭的干骺端。用5 mL注射器吸取含10%FBS的完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔數(shù)次，收集沖出液，用吸管充分吹打均勻，得到細(xì)胞懸液。用1 mL注射器將細(xì)胞懸液按 1×109cells/L 的密度接種到25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中, 置37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h半量換液1次，以后每3 d全量換液1次。待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，傳代培養(yǎng)。雜細(xì)胞隨換液而被逐漸棄除，據(jù)差速貼壁原理，MSCs不斷純化。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29、CD34和CD45，并用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

3.2細(xì)胞增殖活性測定 取生長狀態(tài)良好的P3代MSCs，0.25%胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，以2×106cells/L密度接種于96孔板中，每孔中的體積分別為100 μL。24 h待所有細(xì)胞貼壁后，吸出每孔培養(yǎng)液，換成無血清培養(yǎng)基，24 h細(xì)胞周期同步化后開始添加不同濃度柚皮苷。吸凈每孔培養(yǎng)液，取配制好的不同濃度的柚皮苷工作液，按設(shè)置的濃度加入不同組別，使各組的終濃度分別為1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L，空白組中僅加入完全培養(yǎng)基，不加NG溶液作為對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔終體積200μL。各組添加不同濃度柚皮苷后培養(yǎng)3 d，進(jìn)行MTT檢測。棄去培養(yǎng)液，D-Hanks液沖洗3次，更換無血清的α-MEM培養(yǎng)基180 μL/well，同時(shí)加入5 g/L MTT 20 μL/well，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，小心棄去上清液，加入DMSO 150 μL/well，置微孔板振蕩器上振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上測吸光度(A)值，測量波長為490 nm，以未接種細(xì)胞的空白對(duì)照孔作為調(diào)零孔。

3.3以ALP活性確定NG最佳促骨向分化濃度 采用pNPP法檢測不同濃度NG對(duì)MSCs分化中ALP活性的影響。取P3代細(xì)胞，以5×107cells/L密度接種到6孔板中，每孔3 mL。用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。24 h細(xì)胞周期同步化后，更換為含有不同濃度NG的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后，吸棄孔中的培養(yǎng)基，用D-Hanks洗2遍。每孔加入細(xì)胞裂解液(0.1%Triton X-100)1 mL，4 ℃作用20 min。收集裂解液采用對(duì)硝基酚磷酸鹽法測定ALP濃度。以pNPP為底物，根據(jù)水解磷酯鍵所產(chǎn)生的對(duì)硝基酚量測定酶活力。在37 ℃、pH 10.0條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 μmol/L對(duì)硝基酚的酶量為1個(gè)酶單位。用BCA法測定裂解液中總蛋白濃度，以蛋白含量(μg) 為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出樣品實(shí)際濃度(g/L)。ALP活性以103U/g protein表示。

3.4實(shí)驗(yàn)分組及各項(xiàng)指標(biāo)檢測 確定NG最佳促M(fèi)SCs骨向分化濃度后，以該濃度NG和通路抑制劑對(duì)MSCs進(jìn)行干預(yù)[8-10]。實(shí)驗(yàn)分為6組：(1)空白對(duì)照組(control)；(2)NG組；(3)NG+SB203580(NG+SB)組；(4)NG+PD98059(NG+PD)組；(5)NG+SP600125(NG+SP)組；(6)NG+3種抑制劑(NG+SB+PD+SP)。實(shí)驗(yàn)取P3代均質(zhì)性良好的MSCs以1×108cells/L的密度接種于24孔板，共6組，每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞接種24 h后，換入無血清培養(yǎng)基，24 h細(xì)胞周期同步化后，再加入藥物及完全培養(yǎng)基，每孔終體積1 mL。培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)：(1)空白對(duì)照組每3 d正常換液1次；(2)NG組加入最佳濃度的NG及完全培養(yǎng)基；(3)～(6)組在每次換液前，分別加入3 μmol/L SB203580、4 μmol/L PD98059和5 μmol/L SP600125預(yù)處理30 min，然后加入最佳濃度的NG及完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，加藥后培養(yǎng)3 d與其它各組同時(shí)取細(xì)胞上清液和細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)檢測。

3.4.1ALP活性測定 吸盡各孔培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每孔加200 μL 0.1% Triton X-100，4 ℃冰上裂解，收集細(xì)胞裂解液，取30 μL加于測定管內(nèi)，按照ALP試劑盒說明操作，標(biāo)準(zhǔn)管加入30 μL酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(0.02 g/L)，空白管加入雙蒸水30 μL，各管均加入緩沖液50 μL和基質(zhì)液50 μL，充分混勻，37℃水浴15 min，加入顯色劑150 μL，立即混勻，選擇520 nm波長，酶標(biāo)儀測定各管吸光度。根據(jù)說明書上相應(yīng)公式計(jì)算ALP活性，用金氏單位(King’s unit，每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min 產(chǎn)生1 mg 酚為1個(gè)金氏單位)表示。

3.4.2BGP分泌測定 吸棄孔中的培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL,冰上裂解20 min，收集裂解液-20 ℃保存待測。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及樣品測定按說明書操作，于酶標(biāo)儀上450 nm波長處測定A值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中BGP含量，用μg/g protein表示。

3.4.3ColⅠ含量測定 分別取各組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及樣品測定按說明書操作，于酶標(biāo)儀上490 nm波長處測定A值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ColⅠ含量，結(jié)果用mg/g protein表示。

3.4.4Western blotting檢測磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK和磷酸化p38的表達(dá) 吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，再加入細(xì)胞裂解液4 ℃裂解30 min， 12 000 r/min離心10 min取上清液，用BCA法測蛋白濃度。配制12%分離膠和5%積層膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔上樣量50 μg。以GAPDH作為內(nèi)參照。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉，分別加入兔抗p38抗體、ERK抗體、JNK抗體、GAPDH抗體、p-p38抗體、p-ERK抗體和p-JNK抗體于4 ℃孵育過夜。洗膜，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)的羊抗兔IgG 抗體于室溫孵育1 h。洗膜，ECL顯影曝光，得到膠片，比較各條帶的灰度值，分析所檢測蛋白的磷酸化水平。

3.4.5熒光定量PCR技術(shù)檢測TGF-β1、BMP-2和Cbfα1 mRNA的表達(dá) 總RNA的提取采用Trizol法進(jìn)行，紫外分光光度計(jì)檢測濃度，并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測其完整性。將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以18S rRNA為內(nèi)參照，引物如下：

(1)TGF-β1上游引物5’-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3’,下游引物5’-TGGTTGTAGAG-GGCAAGGAC -3’,擴(kuò)增片段大小為182 bp;(2)BMP-2上游引物5’-GTGAGGATTAGCAGGTCTTTG-3’,下游引物5’-CACCCCACATCACTGAAGTC-3’, 擴(kuò)增片段大小為200 bp;(3)Cbfα1上游引物5’-GATGCCTTAGTGCCCAAATGT-3’,下游引物5’-GGCTGAAGGGTGAAGAAAGC-3’,擴(kuò)增片段大小為130bp;(4)18SrRNA上游引物5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’,下游引物5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC- 3’, 擴(kuò)增片段大小為112 bp。逆轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件均參照說明書設(shè)定。反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析。mRNA的相對(duì)表達(dá)量以相對(duì)樣品初始模板量表示。由公式2-ΔΔCt計(jì)算，相對(duì)樣品初始模板量=2-ΔΔCt的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1MSCs的形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡下觀察剛分離出的細(xì)胞呈圓形，胞體透亮，折光性強(qiáng)，大小不一，與一同從骨髓腔中沖出的雜細(xì)胞相互混雜。24 h首次換液后，可見大量細(xì)胞貼壁，見圖1A。第3 d換液時(shí)可見細(xì)胞伸展，伸出偽足，呈短棒狀，見圖1B。隨時(shí)間延長，貼壁細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，呈短梭形，形態(tài)漸趨均一，見圖1C～D；懸浮的雜細(xì)胞隨換液而被逐漸棄除。細(xì)胞呈梭形，迅速增殖，并逐漸融合成片，呈漩渦狀分布，見圖1E～F。流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠 MSCs 表面標(biāo)志抗原CD29 陽性細(xì)胞比率為99.5%，CD34 及CD45表達(dá)陽性細(xì)胞比率分別為3.3%和0.1%，見圖2。上述結(jié)果符合MSCs的生物學(xué)特性。

Figure 1. Morphology of MSCs observed by inverted microscopy. A～D:MSCs morphology after 24 h(P1), 3 d,6 d and 9 d(P2); E～F:P3 MSCs morphology.

圖1倒置顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)

Figure 2. Phenotypes of rat MSCs observed by FCM.

圖2大鼠MSCs細(xì)胞表型鑒定

掃描電鏡下觀察P3代MSCs為長梭形或多角形，較為粗大，見圖3A。細(xì)胞之間孔隙較多，大小不一，孔隙間多有交通，細(xì)長的絲突相互搭接在一起，形成類似網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞周圍有薄紗樣基質(zhì)成分存在，見圖3B～D。細(xì)胞表面粗糙，有較多突起和細(xì)長的微棘、絲突，并且有許多顆粒物質(zhì)存在，說明該類細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)有較好的活力，貼壁良好。

Figure 3. Morphology of MSCs observed by scanning electron microscopy.

圖3掃描電子顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)

透射電鏡下觀察P3代MSCs細(xì)胞表面有粗細(xì)不均的胞質(zhì)突起，細(xì)胞核大，且呈不規(guī)則形，含1～3個(gè)核仁，核質(zhì)較小，核膜光滑清晰、有凹陷，核內(nèi)有豐富的常染色質(zhì)，細(xì)密、分布均勻，異染色質(zhì)趨邊分布，見圖4。胞漿中有豐富的細(xì)胞器，如核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等，并可見大量的分泌小泡，說明細(xì)胞分泌功能旺盛；胞漿內(nèi)有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體豐富，高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，說明細(xì)胞合成代謝能力旺盛；細(xì)胞表面有較多短而粗的微絨毛突起，胞內(nèi)有較多的初級(jí)溶酶體，表明細(xì)胞吞噬能力旺盛。

Figure 4. Morphology of MSCs observed by transmission electron microscopy.A,B:bar=2 μm;C,Dbar=5 μm.

圖4透射電子顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)

2NG最佳促骨向分化濃度確定

采用MTT法觀察NG對(duì)MSCs增殖活性的影響，結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，NG濃度在10-9mol/L～10-4mol/L范圍內(nèi)均能促進(jìn)MSCs的增殖，且隨NG濃度增加，促增殖作用先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)NG濃度為10-6mol/L時(shí)促增殖作用最強(qiáng),見圖5。

圖5不同濃度NG對(duì)MSCs增殖活性的影響

采用pNPP法觀察NG對(duì)MSCs細(xì)胞ALP活性的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NG能增強(qiáng)ALP活性，且隨NG濃度增加，ALP活性先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)NG濃度為10-7mol/L時(shí)ALP活性最強(qiáng)，見圖6。結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)可知，10-7mol/L在上述促增殖濃度范圍內(nèi)，其促增殖能力也較強(qiáng)。綜合MTT和pNPP實(shí)驗(yàn)，我們選擇10-7mol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)NG的濃度。

圖6不同濃度NG對(duì)MSCs細(xì)胞ALP活性的影響

3各組細(xì)胞骨向分化指標(biāo)ALP、BGP和ColⅠ的表達(dá)

如表1所示，與空白組相比，NG組細(xì)胞ALP活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，BGP分泌顯著升高(P<0.01)，ColⅠ分泌量無明顯差異(P>0.05)。與NG組相比：NG+SB組ALP活性無明顯差異(P>0.05)，BGP分泌量降低(P<0.05)，ColⅠ分泌無明顯差異(P>0.05)；NG+PD組ALP活性顯著降低(P<0.05)，BGP分泌量無明顯差異(P>0.05)，ColⅠ分泌量降低(P<0.05)；NG+SP組ALP活性顯著降低(P<0.05)，BGP分泌顯著降低(P<0.05)，ColⅠ分泌量無明顯差異(P>0.05)；NG+SB+PD+SP組細(xì)胞ALP活性顯著降低(P<0.05)，BGP含量無明顯差異(P>0.05)，ColⅠ含量降低(P<0.05)。

表1各組ALP、BGP和ColⅠ的表達(dá)水平

GroupALP(King’sunit)BGP(μg/gprotein)ColⅠ(mg/gprotein)Control0.465±0.0160.508±0.2090.024±0.001NG0.524±0.027*1.972±0.249**0.025±0.002NG+SB0.504±0.021*1.088±0.456*△0.023±0.003NG+PD0.469±0.030△1.171±0.705*0.018±0.002*△NG+SP0.473±0.029△0.398±0.219△0.022±0.003*NG+SB+PD+SP0.413±0.016*△0.260±0.266*0.019±0.005*△

*P<0.05 ,**P<0.01vscontrol;△P<0.05vsNG group .

4各組p38、ERK1/2和JNK蛋白磷酸化的水平

如圖7所示，NG組與空白組相比p38的磷酸化減少(P<0.01)，JNK磷酸化增加(P<0.05)，ERK1/2磷酸化無明顯差異(P>0.05)。與NG組相比，NG+SB組p38磷酸化增加(P<0.05)，表現(xiàn)出向空白組變化的趨勢，同時(shí)伴隨了JNK磷酸化的減少(P<0.05)，ERK1/2磷酸化無明顯差異(P>0.05)；NG+PD組p38磷酸化增加(P<0.05)，ERK1/2的磷酸化明顯減少(P<0.05)，JNK磷酸化無明顯差異(P>0.05)；NG+SP組ERK1磷酸化增加(P<0.05)，JNK磷酸化減少(P<0.05)，p38和ERK2的磷酸化無明顯差異(P>0.05)；NG+SB+PD+SP組ERK1的磷酸化增加(P<0.05)，JNK磷酸化減少(P<0.05)，p38和ERK2的磷酸化無明顯差異(P>0.05)。

5各組TGF-β1、BMP-2和Cbfα1mRNA的表達(dá)

結(jié)果如表2所示，與空白組相比，NG組TGF-β1表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，BMP-2表達(dá)量增加(P<0.01)，Cbfα1表達(dá)量減少(P<0.05)。與NG組比較，NG+SB組TGF-β1mRNA表達(dá)量減少(P<0.05)，BMP-2表達(dá)量減少(P<0.05)，Cbfα1表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)；NG+PD組TGF-β1mRNA表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，BMP-2表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，Cbfα1表達(dá)量減少(P<0.05)；NG+SP組TGF-β1mRNA表達(dá)量減少(P<0.05)，BMP-2表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，Cbfα1表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)；NG+SB+PD+SP組TGF-β1表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，BMP-2表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，Cbfα1表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。

圖7各組磷酸化p38、ERK和JNK的表達(dá)

表2各組TGF-β1、BMP-2和Cbfα1mRNA的表達(dá)水平

GroupTGF-β1BMP-2Cbfα1Control1.47±0.061.00±0.051.91±0.17NG1.42±0.272.08±0.34**1.33±0.05*NG+SB1.00±0.17*△1.17±0.05△1.34±0.30NG+PD1.12±0.09*1.41±0.28*1.10±0.09*△NG+SP1.07±0.15*△1.35±0.45*2.45±0.49NG+SB+PD+SP1.12±0.28*1.05±0.03△1.30±0.29*

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05vsNG group.

討 論

MSCs的多向分化潛能在骨的形成和吸收方面具有重要的生理意義，尤其是分化為OB的這一重要特性，使之在骨組織工程研究中作為理想的種子細(xì)胞而受到重視。其來源廣泛、取材簡便、體外培養(yǎng)要求條件不高、細(xì)胞增殖快、生長穩(wěn)定、經(jīng)多次傳代成骨能力不減弱，而且作為未分化的干細(xì)胞，其細(xì)胞表型尚不成熟、自體或同種異體移植后排斥反應(yīng)輕等，因此在骨性疾病的治療上擁有良好的應(yīng)用前景。MSCs向OB分化受到多方面因素的影響，如激素、細(xì)胞因子等，且受多種信號(hào)通路調(diào)控，其中與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切。MAPK家族包含五大類成員，分別為ERK1/2、JNK/應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)、p38 MAPK、ERK5/big MAP kinase 1(BMK1)和ERK3/4 等。MAPK通路作為細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一，可參與細(xì)胞的形成、運(yùn)動(dòng)、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程，在MSCs骨向分化過程中發(fā)揮著重要作用[11]。

本文選擇MAPK通路中的p38、ERK及JNK 3條通路作為研究對(duì)象，以ALP、BGP以及ColⅠ為指標(biāo)觀察其對(duì)MSCs骨向分化能力的影響，并初步探究了其與骨轉(zhuǎn)化調(diào)控因子TGF-β1、BMP-2和Cbfα1之間的關(guān)系。ALP是成骨細(xì)胞分化早期和中期的一個(gè)標(biāo)志性蛋白[12]；此外，ALP作為一種細(xì)胞內(nèi)酶，活性越高說明前成骨細(xì)胞向成熟OB分化越明顯，因此其可作為OB功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)來衡量MSCs向OB方向分化的程度[13]。BGP是成骨細(xì)胞分化晚期的一個(gè)標(biāo)志性蛋白，它是一個(gè)成骨細(xì)胞特異性蛋白。ColⅠ是成骨細(xì)胞正常分化及鈣化所必需的蛋白。TGF-β1、BMP-2和Cbfα1是與MSCs骨向分化密切相關(guān)的細(xì)胞因子，在分化過程中起重要作用。TGF-β1是TGF-β超家族的一員，其與骨代謝的關(guān)系最為密切，具有重要的誘導(dǎo)成骨分化、成熟的能力[14-15]。BMPs也屬于TGF-β超家族，是目前公認(rèn)的高效骨誘導(dǎo)因子，它具有誘導(dǎo)OB分化和體外成骨的能力，而且能啟動(dòng)MSCs的成骨過程，其中以BMP-2的成骨能力最強(qiáng)，它被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子[16]。Cbfα1屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族，近年來的研究已證明其是OB分化和骨形成的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]。

本文的研究表明NG能提高M(jìn)SCs細(xì)胞的ALP活性，增加BGP分泌量，證明其具有顯著的促進(jìn)MSCs骨向分化的作用，其最佳促骨向分化濃度為10-7mol/L 。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在NG促M(fèi)SCs骨向分化過程中，MAPK通路中的p38、ERK和JNK這3條分通路起著至關(guān)重要的作用。MAPK信號(hào)通路中這3條通路激活的時(shí)間順序是不一樣的[18-21]，所起的作用強(qiáng)弱也不一樣。本文通過對(duì)ALP、BGP和ColⅠ指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn)，阻斷p38或ERK或JNK任一通路都會(huì)減弱NG促M(fèi)SCs骨向分化的能力，表明這3條通路都在NG促M(fèi)SCs骨向分化過程中發(fā)揮重要作用。其中ERK和JNK通路對(duì)MSCs骨向分化能力的影響較顯著，表明NG可能主要通過ERK以及JNK這2條MAPK通路促進(jìn)MSCs骨向分化。Western blotting 實(shí)驗(yàn)中NG組與對(duì)照組相比下調(diào)了p38磷酸化水平，上調(diào)了JNK的磷酸化水平；而將p38抑制劑組與NG組比較， p38磷酸化增加，ERK1和JNK磷酸化降低，表現(xiàn)出向?qū)φ战M變化的趨勢，ERK2沒有明顯變化。這一結(jié)果表明加入p38通路抑制劑SB203580后，抑制了NG對(duì)p38、ERK1和JNK磷酸化水平調(diào)節(jié)的能力；同時(shí)還表明p38通路不僅與p38的磷酸化有關(guān)，還影響ERK1和JNK磷酸化，這也從一個(gè)方面表明MARK通路中的p38、ERK和JNK是一個(gè)相互聯(lián)系的有機(jī)整體。與NG組相比，ERK抑制劑組ERK磷酸化水平降低，JNK抑制劑組JNK磷酸化水平降低，表明ERK、JNK通路抑制劑的加入，都減弱了NG的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果進(jìn)一步表明NG主要是通過激活ERK、JNK通路從而促進(jìn)MSCs骨向分化。3種抑制劑都加入，反而對(duì)NG調(diào)節(jié)3種蛋白磷酸化水平的作用無顯著影響，表明在NG促M(fèi)SCs骨向分化過程中除p38、ERK、JNK通路以外，還受MAPK信號(hào)通路中其它通路的影響。這也表明MAPK信號(hào)通路是一個(gè)很復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。作為一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，各個(gè)MAPK通路之間通過復(fù)雜的機(jī)制既可相互區(qū)別，又可相互調(diào)節(jié)，既有自身的獨(dú)立性，相互之間又有著千絲萬縷的聯(lián)系。其中p38、ERK、JNK這3條MAPK通路，或是在上游蛋白激酶，或是在下游作用底物處有其通路的交匯。正是這種復(fù)雜的多聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，確保了細(xì)胞反應(yīng)的精確性和準(zhǔn)確性。通過熒光定量PCR檢測各組骨向分化調(diào)控因子TGF-β1、BMP-2和Cbfα1 mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)指標(biāo)尤其是BMP-2的表達(dá)與MAPK通路的p38通路密切相關(guān)；同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NG可能主要是通過上調(diào)BMP-2的表達(dá)來促進(jìn)骨向分化。

綜上所述，本文的研究表明：NG具有顯著促進(jìn)MSCs骨向分化的能力；NG主要是通過激活MAPK信號(hào)通路中ERK通路、JNK通路，以及上調(diào)BMP-2的表達(dá)，來促進(jìn)MSCs骨向分化的；NG上調(diào)BMP-2的表達(dá)受MAPK通路中p38通路的影響較大。

[1] 曾芬芳, 黃 河. 間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2007, 29(3): 336-340.

[2] 于宏偉, 谷維娜, 李 娜，等. 柚皮苷的提取方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 50(8): 1516-1518.

[3] 鄧展生, 張 璇, 鄒冬青, 等. 骨碎補(bǔ)有效成分柚皮甙對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響[J]. 湘南學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 7 (4): 5-7.

[4] 劉新迎, 周 聯(lián), 梁瑞燕, 等. 柚皮苷對(duì)前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖和誘導(dǎo)分化的影響[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2007, 18(3): 176-179.

[5] 武密山, 趙素芝,任立中，等. 柚皮苷對(duì)乳鼠成骨細(xì)胞增殖及c-fos、c-jun表達(dá)的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2011, 27(5): 667-681.

[6] 歐陽菁. 柚皮苷對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和骨向分化的影響[D]. 廣州: 暨南大學(xué)，2006.

[7] 周 榮, 姚 巍, 李彥紅, 等. 環(huán)磷酸腺苷葡甲胺誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(10): 2040-2044.

[8] Gong J,Shen X,Qiu H, et al. Down-regulation of HIV-1 Infection by Inhibition of The MAPK Signaling Pathway[J]. Virol Sin, 2011, 26(2):114-122.

[9] 廖清船, 肖洲生, 秦艷芳, 等. 植物雌激素金雀異黃酮通過p38MAPK通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(6): 683-687.

[10]王和鳴, 王 力, 李 楠．巴戟天對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]．福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 14(3)：16-20．

[11]Yamaguchi A, Komori T, Suda T．Regulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfa1[J]．Endocr Rev, 2000, 21(4): 393-411.

[12]Sierra RI, Specker BL, Jimenez F, et al. Biochmical bone markers, bone mineral content, and bone mineral density in rats with experimental nephritic syndrome[J]. Ren Fail, 1997, 19(3): 409-24.

[13]廖二元, 譚利華. 代謝性骨病學(xué)[M]. 第1版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2003：1-78.

[14]石義剛, 陶天遵, 徐 強(qiáng), 等. TGF-β對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及OPG 基因mRNA表達(dá)的影響[J]. 中國骨腫瘤骨病, 2003, 2(3): 170-172，192.

[15]王小娜, 李 正, 王 瑒, 等. TGF-β1在雷奈酸鍶促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(12): 2357-2361.

[16]Okubo Y, Bessho K, Fujimura K, et al. Osteoinduction by recombinant human bone morphogenetic protien-2 at intramuscular, intemuscular, subcutaneous and intrafatty sites[J]. Int J Oral Maxillofac Surg, 2000, 29(1): 62-66.

[17]Zhang X,Aubin JE,Inman RD. Molecular and cellular biology of new bone formation: insights into the ankylosis of ankylosing spondylitis[J]. Curr Opin Rheumatol, 2003, 15(4): 387-393.

[18]謝興文, 徐世紅, 李 寧. 中藥單味或單體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化研究概況[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志, 2010, 18(10)：65-67.

[19]Yuan Y, Wu ZJ, Yao HY, et al. Activation of p38 mitogen-activated protein kinase contribute to BMP4-induced alkaline phosphatase expression in MC3T3-E1 preosteoblast[J]. Chin Med J(Engl), 2006, 119(4): 324-327.

[20]Jaiswal RK, Jaiswal N, Bruder SP, et al. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase [J]. J Biol Chem, 2000，275(73)：9645-9652.

[21]Suzuki A, Guicheux J, Palmer G, et al. Evidence for a role of p38 MAP kinase in expression of alkaline phosphatase during osteoblastic cell differentiation [J]. Bone, 2002，30(1)：91-98.

EffectsofnaringinonMAPKsignalpathwayinratbonemarrowmesenchymalstemcellsduringosteogenicdifferentiation

WANG Tian, YANG Li, ZHANG Rong-hua

(DepartmentofChineseMateriaMedica,PharmacyCollege,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzrh@jnu.edu.cn)

AIM: To study the effects of Chinese herbal monomer naringin (NG) on the MAPK signal pathway in bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) derived from SD rats during the differentiation into osteoblastsinvitro.METHODSThe changes of evaluating indicators alkaline phosphatase (ALP), bone gla protein (BGP) and type I collagen (Col I) in MSCs were observed under the conditions of normal, adding p38 pathway inhibitor SB203580, adding extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway inhibitor PD98059, adding c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway inhibitor SP600125, and adding SB203580, PD98059 and SP600125 together. The protein phosphorylation of p38, ERK1/2 and JNK was measured by Western blotting. The mRNA expression levels of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and core binding factor α1 (Cbfα1) were measured by fluorescence quantitative PCR.RESULTSThe most effective concentration of NG to promote the differentiation of MSCs into osteoblasts was 10-7mol/L. The highest expression levels of both ALP and BGP were observed in NG group (P<0.05), while the expression of Col I did not reveal significant difference (P>0.05). Compared with NG group, the expression levels of ALP, BGP and Col I decreased differently after adding different inhibitors. Compared with control group, the protein phosphorylation of JNK was increased (P<0.05), and the phosphorylation of p38 was decreased (P<0.05), while the phosphorylation of ERK1/2 did not reveal significant difference (P>0.05) in NG group. Compared with NG group, the protein phosphorylation of p38, ERK1/2 and JNK showed fluctuation with some increasing and others decreasing. Compared with control group, the expression of BMP-2 was increased (P<0.05), and the expression of Cbfα1 was decreased(P<0.05), while the expression of TGF-β1did not reveal significant difference (P>0.05) in NG group. Compared with NG group, the mRNA expression levels of TGF-β1, BMP-2 and Cbfα1 decreased differently after adding different inhibitors.CONCLUSIONActivation of ERK/JNK signaling and up-regulation of BMP-2 expression may be the main mechanism of NG to promote the differentiation of MSCs into osteoblasts. NG has strong impact on p38 pathway to improve the expression of BMP-2 in MSCs.

Naringin; Bone marrow mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation; MAPK signal pathway

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.001