李 茜， 沈華浩

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸科，浙江 杭州 310009; 2浙江省人民醫(yī)院 ICU，浙江 杭州 310014)

1000-4718(2012)03-0512-06

2011-07-24

2012-01-05

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No.J20040116)；衛(wèi)生部科學(xué)研究基金-浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技計劃項目(No.WKJ 2005-2-039)

△通訊作者 Tel: 0571-87783729; E-mail:hh_shen@yahoo.com.cn

Foxp3轉(zhuǎn)染對哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞功能的影響*

李 茜2， 沈華浩1△

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸科，浙江 杭州 310009;2浙江省人民醫(yī)院 ICU，浙江 杭州 310014)

目的轉(zhuǎn)染Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞，探討Foxp3表達(dá)對脾淋巴細(xì)胞功能的影響。方法卵白蛋白(OVA)致敏激發(fā)制作哮喘小鼠模型，收集培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞；使用電穿孔法轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-Foxp3至脾臟淋巴細(xì)胞，并設(shè)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和對照組；RT-PCR和Western blotting檢測Foxp3的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后CD4+CD25+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比例；MTT法檢測轉(zhuǎn)染后的脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，ELISA檢測脾淋巴細(xì)胞上清中白細(xì)胞介素4(IL-4)和干擾素γ(IFN-γ)的含量。結(jié)果轉(zhuǎn)染組Foxp3 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平顯著高于空質(zhì)粒組和對照組；轉(zhuǎn)染Foxp3后CD4+CD25+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比例顯著高于空質(zhì)粒組和對照組；與空質(zhì)粒組和對照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Foxp3質(zhì)粒明顯抑制了脾淋巴細(xì)胞增殖；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清中IL-4和IFN-γ含量低于空質(zhì)粒組和對照組。結(jié)論轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞，F(xiàn)oxp3得到有效表達(dá)。Foxp3的高表達(dá)能增加CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)量，抑制哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖以及Th1和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

T淋巴細(xì)胞; 轉(zhuǎn)錄因子; 哮喘; 小鼠; 脾

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell，Treg細(xì)胞)被認(rèn)為參與重要免疫耐受機(jī)制，能夠抑制獲得性免疫反應(yīng)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是最為重要的一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其表面持續(xù)表達(dá)CD25，能夠抑制效應(yīng)性CD4+和CD8+細(xì)胞的功能。越來越多的證據(jù)表明，過敏性疾病和哮喘中存在CD4+CD25+Treg細(xì)胞的功能缺陷或數(shù)目異常，而CD4+CD25+Treg細(xì)胞能夠抑制這些疾病的變態(tài)反應(yīng)炎癥的發(fā)展。Foxp3(forkhead box P3)是調(diào)控CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育及啟動抑制功能的總開關(guān)，特異性表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面。本研究將Foxp3的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，檢測基因表達(dá)情況并探討對轉(zhuǎn)染細(xì)胞功能的影響。

材 料 和 方 法

1動物

清潔級小鼠，6～8周齡，體重17～22 g，雌雄不拘，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。

2主要試劑與儀器

pcDNA3.1(-)-Foxp3和pcDNA3.1(-)質(zhì)粒由德國Mainz大學(xué)免疫所Michael Stassen教授饋贈，大腸桿菌BL21為本實驗室保存，限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindIII (大連寶生物工程公司)，UNIQ-10柱離心式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海生工生物技術(shù)公司)，鼠源性逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Promega), RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco)，Supersignal West Femto試劑盒(Pierce)，大鼠anti-mouse CD4- FITC mAb (BD)，大鼠anti-mouse CD25-PE mAb(BD)，小鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4 ELISA 試劑盒(R&D)，小鼠干擾素(interferon,IFN)-γ ELISA 試劑盒(R&D)。

3方法

3.1質(zhì)粒的擴(kuò)增與鑒定

3.1.1感受態(tài)BL21菌的制備 取大腸桿菌BL21按細(xì)菌儲存液∶培養(yǎng)液1∶100接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；按過夜培養(yǎng)菌液∶培養(yǎng)液1∶100接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h；使菌體呈毛玻璃狀即可。分裝于1.5 mL EP管中，4 000 r/min離心10 min，棄上清，吸干多余殘液；每管加1 mL 0.1 mol/L冰CaCl2，輕輕吹打均勻，冰浴30 min；4 000 r/min 離心10 min，棄上清；每管加200 μL 0.1 mol/L冰CaCl2，輕輕吹打均勻。

3.1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌 上述每管置冰上加入0.5 μL pcDNA3.1(-)-Foxp3或pcDNA3.1(-)質(zhì)粒，輕輕吹打均勻；冰浴30 min；42 ℃熱休克 90 s；迅速放回冰浴2 min；加500 μL液體培養(yǎng)基37℃、200 r/min×1 h；鋪到含氨芐青霉素(100 mg/L)平板和陰性平板中37 ℃培養(yǎng)過夜；陽性平板上挑取單個菌落，于含有氨芐青霉素培養(yǎng)液中37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。

3.1.3抽提質(zhì)粒 按質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行。DNA樣品濃度=A260×稀釋倍數(shù)×50/1 000(g/L)，重復(fù)1次取平均值為該樣品的濃度。

3.1.4pcDNA3.1(-)-Foxp3質(zhì)粒的酶切鑒定 前步所得的質(zhì)粒 DNA 用HindIII 和EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物于0.9%凝膠電泳，紫外線下分析，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

3.2質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染脾淋巴細(xì)胞

3.2.1脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞制備 C57BL/6小鼠，以卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏激發(fā)制作哮喘小鼠，模型鼠處死后，無菌取脾，剪取部分脾臟以200目濾網(wǎng)研磨，制備脾細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整濃度。

3.2.2質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染脾淋巴細(xì)胞

①脾淋巴細(xì)胞懸液洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×1010/L，每次電轉(zhuǎn)杯中加入細(xì)胞懸液 200 μL+ pcDNA3.1(-)-Foxp3質(zhì)粒4 μg，冰浴10 min。

②選擇電壓350 V，電容 25 μF，時間 2 ms，電擊一次，電擊后再冰浴10 min。

③吸細(xì)胞懸液至1.5 mL EP管中，5000 r/min離心10 min，向電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，稀釋至2×109/L，每孔2 mL接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入終濃度為40 mg/L的OVA液，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)60 h。

同時用質(zhì)粒pcDNA3.1(-)相同方法和條件電穿孔轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞作為空質(zhì)粒組，相同條件下培養(yǎng)的未予轉(zhuǎn)染的脾淋巴細(xì)胞作為對照組。各3孔為1例，每組例數(shù)n=8。

3.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的基因表達(dá)的檢測

3.3.1RT-PCR檢測脾淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá) 以GAPDH為內(nèi)參照，半定量RT-PCR檢測Foxp3 mRNA的表達(dá)。具體如下：取前述所得脾淋巴細(xì)胞2×106，提取總RNA，取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)條件：70 ℃預(yù)變性5 min，加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U，再于42 ℃孵育60 min，72 ℃加熱10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。取等量cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列見表1，反應(yīng)條件：Foxp3為94 ℃變性3 min,下述條件循環(huán)10 次，變性94 ℃ 10 s、退火70 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 20 s，再按下述條件循環(huán)30次，變性94 ℃ 10 s、退火60 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 20 s,最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃冷卻5 min結(jié)束反應(yīng)；GAPDH為94 ℃變性3 min,按下述條件循環(huán)30次，變性94 ℃ 15 s、退火57 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃冷卻5 min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，用Biosens Gel Imaging System進(jìn)行吸光度值掃描，以Foxp3和GAPDH條帶吸光度比值作為Foxp3 mRNA水平。

表1 RT-PCR使用的引物序列

3.3.2Western blotting檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Foxp3蛋白的表達(dá) 取前述所得脾淋巴細(xì)胞2×106，以蛋白提取液提取蛋白，用BAC蛋白定量試劑盒定量；取40 μg待測蛋白加入6×加樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min；灌注10%聚丙烯酰胺凝膠,上樣，電泳 80 V 45 min、200 V 90 min；轉(zhuǎn)膜前10 min將硝酸纖維膜和濾紙浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，恒定電壓100 V轉(zhuǎn)膜1 h；脂奶粉室溫阻斷2～3 h；加Foxp3Ⅰ抗室溫結(jié)合2 h，BST洗滌3次，每次10 min，加Ⅱ抗，室溫結(jié)合1h，TBST洗滌3次，每次10 min；ECL顯色后將濾膜在暗室曝光后顯影,定影，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)BioSenSC300進(jìn)行條帶吸光度值掃描。以GAPDH作為內(nèi)參照,同樣進(jìn)行以上反應(yīng)。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD4+CD25+細(xì)胞/CD4+細(xì)胞的比例 測定管和陰性對照管各加入前述所得脾淋巴細(xì)胞1×106(100 μL)，測定管加入FITC-anti-CD4抗體和PE-anti-CD25抗體各10 μL，陰性對照管加入同型對照 FITC-rat IgG2b和 PE-rat IgG2b各10 μL，分別避光孵育30 min，PBS洗滌2次后，1%多聚甲醛0.5 mL混懸，上流式細(xì)胞儀檢測。

3.5轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖活性的檢測 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×109/L，200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，每組8孔，均設(shè)3復(fù)孔。加入40 mg/L OVA液，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)60 h。于每孔加入MTT(5 g/L)，20 μL/well，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。離心后吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL，振蕩 15 min后在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處吸光度值。實驗時設(shè)置調(diào)零孔，加培養(yǎng)基、MTT、DMSO。

3.6ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液細(xì)胞因子含量 收集細(xì)胞上清液，放置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于ELISA檢測。使用小鼠IL-4和IFN-γ ELISA 試劑盒檢測脾淋巴細(xì)胞上清細(xì)胞因子。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1質(zhì)粒的雙酶切鑒定

根據(jù)pcDNA3.1-Foxp3的質(zhì)粒圖譜,目的基因和質(zhì)粒載體在HindIII和EcoR I酶切點連接，故對質(zhì)粒進(jìn)行HindIII和EcoR I雙酶切電泳鑒定，得到約1 300 bp的片段，,見圖1，與Foxp3理論值大小相符。

Figure 1. Double endonuclease digestion products of pcDNA3.1(-)-Foxp3. M:marker；Lane 1: pcDNA3.1(-)-Foxp3; Lane 2: pcDNA3.1(-) and Foxp3.

圖1pcDNA3.1(-)-Foxp3雙酶切產(chǎn)物的電泳圖譜

2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Foxp3mRNA和蛋白的表達(dá)

結(jié)果見圖2、3和表2，轉(zhuǎn)染組Foxp3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于空質(zhì)粒組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；空質(zhì)粒組和對照組Foxp3表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

Figure 2. Foxp3 mRNA expression in splenocyte. Lane 1: transfection group；Lane 2: empty vector group；Lane 3: control group.

圖2轉(zhuǎn)染細(xì)胞Foxp3mRNA的表達(dá)

Figure 3. Foxp3 protein expression in splenocyte. Lane 1: transfection group； Lane 2: empty vector group； Lane 3: control group.

圖3轉(zhuǎn)染細(xì)胞Foxp3蛋白的表達(dá)

表2各組脾淋巴細(xì)胞中Foxp3mRNA和蛋白的表達(dá)

GroupFoxp3mRNAFoxp3proteinTransfection2.138±0.548**2.184±0.529**Emptyvector0.954±0.1761.048±0.266Control0.908±0.2700.896±0.182

**P<0.01vsempty vector group or control group.

3轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Foxp3質(zhì)粒對脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比例的影響

轉(zhuǎn)染組CD4+CD25+細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比例為(28.28±2.48)%，顯著高于空質(zhì)粒組和對照組[(11.05±2.53)% 和(9. 27±2.04)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖4。

4轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Foxp3質(zhì)粒對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

與空質(zhì)粒組和對照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Foxp3質(zhì)粒明顯抑制脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01),見圖5。

5轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Foxp3質(zhì)粒對脾淋巴細(xì)胞上清液IL-4和IFN-γ水平的影響

轉(zhuǎn)染組IL-4含量低于空質(zhì)粒和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；轉(zhuǎn)染組IFN-γ含量低于空質(zhì)粒和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)?？召|(zhì)粒組和對照組中各細(xì)胞因子含量均無明顯差異,見圖6。

圖4轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD4+CD25+/CD4+比例

圖5轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖活性的變化

圖6ELISA檢測脾淋巴細(xì)胞上清IL-4、IFN-γ含量

討 論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞由1995年Sakaguchi等[1]首次報道，作為一種具有獨特免疫調(diào)節(jié)作用的專職抑制細(xì)胞引起廣泛關(guān)注，已被證明在自身免疫性疾病、腫瘤免疫、微生物感染及包括支氣管哮喘在內(nèi)的過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3特異性高表達(dá)在胸腺和外周CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面，是CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異性的標(biāo)志，F(xiàn)oxp3是調(diào)控CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育及啟動抑制功能的總開關(guān)基因[2-5]。本實驗將Foxp3的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，并對基因表達(dá)情況及對轉(zhuǎn)染細(xì)胞功能的影響進(jìn)行研究。

本實驗采用電穿孔轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)pcDNA3.1(-)-Foxp3和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠脾淋巴細(xì)胞，RT-PCR和Western blotting結(jié)果均證實，轉(zhuǎn)染組Foxp3 mRNA和蛋白含量均顯著高于空質(zhì)粒組和對照組，證明轉(zhuǎn)染的真核表達(dá)載體所攜帶的Foxp3基因在小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)得到了有效表達(dá)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步對脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行表型分析，高表達(dá)Foxp3的轉(zhuǎn)染組中CD4+CD25+細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比例顯著高于空質(zhì)粒組和對照組，F(xiàn)oxp3的表達(dá)誘導(dǎo)了CD4+CD25+細(xì)胞的產(chǎn)生。

Foxp3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，2001年由Brunkow等[6]首次報道，研究發(fā)現(xiàn)，它的表達(dá)及功能與Treg細(xì)胞密切相關(guān)。小鼠Foxp3基因編碼的蛋白質(zhì)由429個氨基酸組成，而其特征性的叉頭樣DNA結(jié)合域與家族中其它成員不同，靠近蛋白末端[7]。有學(xué)者認(rèn)為Foxp3這種特殊結(jié)構(gòu)使其不能活化相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，因而能發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄的作用。Foxp3對CD4+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)育是必需的，F(xiàn)oxp3的表達(dá)足以激活CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)揮其抑制功能。用攜帶Foxp3逆轉(zhuǎn)病毒載體向CD4+CD25-T細(xì)胞導(dǎo)入Foxp3則可實現(xiàn)后者向CD4+CD25+Treg的轉(zhuǎn)化[3]。因此，F(xiàn)oxp3的表達(dá)不是T細(xì)胞活化的結(jié)果，而是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的一個特異性標(biāo)志，F(xiàn)oxp3調(diào)控了CD4+CD25+Treg的分化發(fā)育。本實驗中在小鼠脾淋巴細(xì)胞高表達(dá)的Foxp3，誘導(dǎo)獲得了CD4+CD25+Treg細(xì)胞，為進(jìn)一步研究Foxp3和CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能搭建了一個平臺。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)Foxp3的轉(zhuǎn)染組脾淋巴細(xì)胞在抗原OVA刺激下增殖受到了明顯抑制。Hori等[3]的研究也表明Foxp3轉(zhuǎn)染的CD25-T細(xì)胞在體外可以細(xì)胞-細(xì)胞接觸抑制的方式抑制CD4+CD25-應(yīng)答T細(xì)胞活化和增殖以及IL-2分泌。以往認(rèn)為CD4+CD25+Treg細(xì)胞是通過影響了抗原呈遞細(xì)胞的功能而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的，而現(xiàn)在傾向于它并不直接作用于抗原呈遞細(xì)胞，但抗原呈遞細(xì)胞為CD4+CD25+T細(xì)胞同靶細(xì)胞接觸提供作用平臺。CD4+CD25+Treg細(xì)胞很可能通過活化后表達(dá)CTLA-4或膜型TGF-β與靶細(xì)胞表面的CD80、CD86或TGF-β受體相互作用，使靶細(xì)胞休止于細(xì)胞周期G0/G1期而停止增殖，從而介導(dǎo)對靶細(xì)胞的抑制作用。Choi等[8]分別將Foxp3基因轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞和原代T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Foxp3能誘導(dǎo)這些細(xì)胞血紅素加氧酶(heme oxygenase-1,HO-1)的表達(dá)，并通過HO-1依賴的途徑抑制未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖。

活化的CD4+T輔助細(xì)胞(Th)按其功能和分泌的細(xì)胞因子的不同至少分為2群：Th1和Th2，IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特異性細(xì)胞因子。Th1、Th2細(xì)胞因子可促進(jìn)本亞群和抑制另一亞群的生長分化。本實驗中，轉(zhuǎn)染Foxp3的脾淋巴細(xì)胞Th1、Th2細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4分泌均受抑制。一方面，細(xì)胞增殖的受抑可能導(dǎo)致了分泌IL-4和IFN-γ的活化的CD4+Th細(xì)胞減少，從而細(xì)胞因子表達(dá)減少。同時，F(xiàn)oxp3也可能作為細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄抑制子發(fā)揮作用。與本實驗結(jié)果相佐的研究表明，na?ve T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄Foxp3后，細(xì)胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ的表達(dá)受到抑制[3,9]，而Foxp3突變的Scurfy小鼠大量表達(dá)IL-4和IFN-γ等細(xì)胞因子[10]。目前，對于Foxp3的下游信號途徑還不甚了解。研究證明[9]，F(xiàn)oxp3的結(jié)合位點位于IL-2啟動子旁的活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)附近，F(xiàn)oxp3可能通過阻止NFAT向IL-2啟動子的募集來抑制IL-2的轉(zhuǎn)錄。Bettelli等[10]研究也表明Foxp3通過阻斷NFAT和核因子 κB(nuclear factor κB,NF-κB)途徑，抑制Th細(xì)胞的功能，抑制細(xì)胞因子基因表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；同時發(fā)現(xiàn)，與WT(野生型)小鼠比較，Scurfy小鼠來源的T細(xì)胞出現(xiàn)NFAT和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的明顯提高，給Scurfy小鼠來源的T細(xì)胞Foxp3后，NFAT和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性恢復(fù)到正常水平。也有研究提示，Treg細(xì)胞不是通過抑制Th1細(xì)胞的分化及其特異的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的活性，而可能通過促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，通過細(xì)胞因子間的作用來抑制IFN-γ的產(chǎn)生[11]。

本實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞，F(xiàn)oxp3得到有效表達(dá)。Foxp3的高表達(dá)能增加CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)量，抑制哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖和Th1和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Foxp3作為CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持的主要調(diào)節(jié)基因，對它的功能研究有利于深入了解CD4+CD25+Treg細(xì)胞的起源及功能，有利于更好地了解CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制。對Foxp3表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，可誘導(dǎo)外周CD4+CD25+Treg細(xì)胞，為臨床治療哮喘等過敏性疾病提供新的基因治療途徑。

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EffectsofFoxp3transfectiononsplenocytefunctionsinasthmamice

LI Qian2, SHEN Hua-hao1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,TheSecondAffiliatedHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310009,China;2IntensiveCareUnit,People’sHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou310014,China.E-mail:hh_shen@yahoo.com.cn)

AIM: To study the expression and the effects of Foxp3 on the immunologic functions by transfecting the Foxp3 eukaryotic expression plasmid into the splenocytes of the asthma mice.METHODSThe mice were sensitized and challenged by ovalbumin to make asthma model. The splenocytes were harvested and cultured. The Foxp3 expression vector pcDNA3.1(-)-Foxp3 was transfected into the splenocytes with electroporation. The splenocytes transfected with empty vector [pcDNA3.1(-)] and control splenocytes (non-transfected) were also set up. The expression of Foxp3 at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and Western blotting, respectively. The proportion of CD4+CD25+Treg cells/CD4+cells was measured by flow cytometry. Proliferation of the splenocytes was analyzed with MTT assay. ELISA was used to determine the levels of interleukin 4 (IL-4) and interferon γ (IFN-γ) in the supernatant of the splenocytes.RESULTSThe expression of Foxp3 at mRNA and protein levels in transfection group was significantly higher than that in empty vector group and control group. The proportion of CD4+CD25+Treg cells/CD4+cells in transfection group was higher than that in empty vector group and control group. The proliferation of transfected cells was markedly inhibited compared with empty vector group and control group. The levels of IL-4 and IFN-γ were significantly lower in transfection group than those in empty vector group and control group.CONCLUSIONThe transfectedFoxp3 gene overexpresses in the splenocytes of asthma mice. Foxp3 increases the number of CD4+CD25+T cells and inhibits the proliferation and production of Th1/Th2 cytokines in splenocytes.

T-lymphocytes; Transcription factor; Asthma; Mice; Spleen

R392

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.022