許 希, 饒本強(qiáng), 梁綺雯 劉 丹, 譚 獲, 汪建平△, 黃振倩△

(1廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心，廣東 廣州 510230；2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東 廣州 510655)

1000-4718(2012)03-0420-07

2011-07-31

2011-12-21

△通訊作者 汪建平 Tel:020-38250737; E-mail:wangjpgz@yahoo.com.cn; 黃振倩 Tel:020-34294310;E-mail:huangzq2003@yahoo.com.cn

▲并列第1作者

以組織因子為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療結(jié)合物的合成及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響

許 希1▲, 饒本強(qiáng)2▲, 梁綺雯2劉 丹1, 譚 獲1, 汪建平2△, 黃振倩1△

(1廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心，廣東 廣州 510230；2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東 廣州 510655)

目的構(gòu)建含hFVII-LC+hIgG1-Fc cDNA的重組真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株CHO-K1獲得以組織因子(TF)為靶點(diǎn)的免疫治療結(jié)合物用于腫瘤的靶向治療。方法用分子生物學(xué)方法從漢族人肝組織和淋巴細(xì)胞中分別獲得hFVII-LC和hIgG1-Fc DNA片段并用連接酶正向克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒入CHO-K1細(xì)胞，G418加壓篩選獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞；Excel 301無(wú)血清培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)， 培養(yǎng)液Ni-NTA親和層析純化和制備hFVIII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白，ELISA法檢測(cè)該融合蛋白與TF的靶向作用，免疫激活物與結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29及NK細(xì)胞混合培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)合物激活NK細(xì)胞的能力。結(jié)果以漢族人肝組織和淋巴細(xì)胞為模板擴(kuò)增的hFVII-LC和hIgG1-Fc DNA片段經(jīng)測(cè)序證實(shí)與基因庫(kù)報(bào)道的系列完全一致；經(jīng)酶切分析、測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的hFVII-LC+hIgG1-Fc融合基因片段完整地落在真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的閱讀框架中；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑能獲得含pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc陽(yáng)性的CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)1 g/L G418加壓篩選可以獲得分泌hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的單克隆細(xì)胞株；1L Excel 301無(wú)血清培養(yǎng)液用Ni-NTA親和層析純化可以制備1.3 mg hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白，經(jīng)ELISA法鑒定與TF具有高親和力，免疫激活物與結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29及NK細(xì)胞混合培養(yǎng)表現(xiàn)出明顯的激活NK細(xì)胞的能力。結(jié)論成功構(gòu)建了hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體并獲得了分泌hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的CHO-K1單克隆細(xì)胞株，為制備以TF為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療結(jié)合物奠定了基礎(chǔ)。

腫瘤靶向治療; 組織因子; 免疫結(jié)合物; CHO-K1細(xì)胞

組織因子(tissue factor，TF)，是一個(gè)由263個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋白，分子量約為47 kD。生理狀態(tài)下組織因子位于血管壁外膜細(xì)胞，包繞血管的成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、部分上皮細(xì)胞中，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。臨床上發(fā)現(xiàn)多種腫瘤有不同程度的TF過(guò)度表達(dá)，通過(guò)不同檢測(cè)方法都證實(shí)在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞[1-2]、血液惡性腫瘤細(xì)胞[3]、腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)均異常增高而正常組織、細(xì)胞和血管不表達(dá)，基于此，很多腫瘤學(xué)家認(rèn)為T(mén)F是抗血管治療的理想靶點(diǎn)。凝血因子VII(factor VII，F(xiàn)VII)是TF的天然配體，它們之間具有很高的親和力，Hu等[4-5]利用此特性設(shè)計(jì)的免疫結(jié)合物(immunoconjugate, Icon)，由2段FVII肽段和免疫球蛋白G1可結(jié)晶片段(immunoglobulin G1 fragment crystallizable，IgG1-Fc)構(gòu)成，其中FVII肽段與靶細(xì)胞的相應(yīng)配體TF結(jié)合，通過(guò)IgG1-Fc可與自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK cells)和補(bǔ)體C1q結(jié)合而激活NK細(xì)胞和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)而殺傷靶細(xì)胞，在腫瘤治療上表現(xiàn)出顯著的抗血管效應(yīng)，因而被認(rèn)為是一種較有開(kāi)發(fā)前景的以TF為靶點(diǎn)的免疫治療結(jié)合物。但I(xiàn)con 是以完整的FVII分子作為T(mén)F的靶向，容易激發(fā)凝血系統(tǒng)的異常甚至誘發(fā)DIC。本研究中采用中國(guó)漢族人FVII輕鏈(light chain of human factor VII，hFVII-LC)和IgG1-Fc(hIgG1-Fc)構(gòu)建新的以TF為靶點(diǎn)的真核表達(dá)載體并制備和純化免疫結(jié)合物蛋白。

材 料 和 方 法

1試劑與細(xì)胞株

1.1材料 外周血10 mL(健康志愿者抽取)、正常肝組織(肝結(jié)石患者手術(shù)切取)、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(Invitrogen)、DH5α菌株(TaKaRa)、CHO-K1(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))、HT-29細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染了CD16的NK92MI細(xì)胞(耶魯大學(xué)胡志偉教授惠贈(zèng))。

1.2試劑 人淋巴細(xì)胞分離液和RNA提取試劑盒(Promega);PrtoScriptTMM-MuLV Taq RT-PCR Kit試劑盒(Biolabs);DNA膠回收試劑盒，BamH I、EcoR I和XhoI 內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶(NEB);LipofectamineTM2000(Invitrogen);Ni-NTA樹(shù)脂和抗His標(biāo)簽蛋白(Novagen);抗TF抗體(R&D);Calcein-AM (Invitrogen)。

2方法

2.1引物設(shè)計(jì)與目的基因的擴(kuò)增

2.1.1根據(jù)hFVII-LC cDNA、hIgG1-Fc cDNA序列及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒圖譜，設(shè)計(jì)2對(duì)引物。引物由Invitrogen合成，hFVII-LC基因片段上游引物5′ -CGCGGATCCGCCACCATGGCCAACG CGTTCCTGGAGGAGCTG- 3′,下游引物5′- CCGGAATTCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCATTTCT- 3′。hIgG1-Fc基因片段上游引物5′ -CCGGAATTCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT- 3′,下游引物5′-CCGCTCGAGTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTG-GTGTTTACCCGGAGACAGGGAGAG- 3′，在下游引物C端設(shè)計(jì)6×His標(biāo)簽蛋白。

2.1.2肝組織置于RNA保存液中，并于-80 ℃中保存。

2.1.3外周血B淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清和10%雙抗的RPMI-1640并加入植物血凝素(0.1%，Sigma)10 μL，IL-2 1 000 U的完全培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4～6 d。

2.1.4采用RNA提取試劑盒(Promega)分別提取肝組織和淋巴細(xì)胞總RNA。操作方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量與純度。PrtoScriptTMM-MuLV Taq RT-PCR Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA第1鏈，反應(yīng)條件：1 μg肝組織總RNA、50 μmol/L dT23VN 2 μL和dNTP Mix 2 μL混勻，DEPC水調(diào)整至總體積16 μL，70 ℃水浴5 min后加入10×RT buffer 2 μL、RNase inhibitor 1 μL和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，42 ℃水浴1 h，90 ℃水浴5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，DEPC水調(diào)整產(chǎn)物濃度至總體積50 μL。PCR反應(yīng)體系：Taq2×Master Mix 25 μL，上游引物 10 μmol/L 1 μL,下游引物10 μmol/L 1 μL，cDNA產(chǎn)物5 μL，DEPC水18 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min終止反應(yīng)。hFVII-LC PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用同樣的方法對(duì)淋巴細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，獲得hIgG1-Fc基因PCR產(chǎn)物。

2.2pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用BamH I和EcoR I分別雙酶切hFVII-LC PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，于37 ℃在T4 DNA連接酶作用下連接1 h，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選Amp抗性克隆，用PCR、雙酶切及測(cè)序方法鑒定陽(yáng)性克隆pcDNA3.1(+)-hFVII-LC，用同樣的方法及EcoR I、XhoI內(nèi)切酶構(gòu)建pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc 最后酶切及測(cè)序方法鑒定陽(yáng)性克隆。重組表達(dá)載體構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。

Figure 1. The construction of a recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc.

圖1質(zhì)粒構(gòu)建流程圖

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性克隆篩選 參照LipofectamineTM2000(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)，將pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株CHO-K1中，48 h后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按1∶10傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換含G418(Invitrogen) 1 g/L的F12培養(yǎng)基篩選2周。挑取單細(xì)胞陽(yáng)性克隆繼續(xù)在含G418 500 mg/L的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞分別命名為CHO-K1-hFVII-LC+hIgG1-Fc和CHO-K1空細(xì)胞。

2.4用半定量RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染是否成功 收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO-K1-hFVII-LC+hIgG1-Fc和CHO-K1細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒分別抽提2種細(xì)胞總RNA(Promega)。用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA，取cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hFVII-LC基因片段引物同上，hFVII-LC+hIgG1-Fc重組基因片段上游引物5′-CGCGGATCCGCCACCATGGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTG- 3′,下游引物5′ -CCGCTCGAGTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTT-ACCCGGAGACAGGGAGAG- 3′。GAPDH(內(nèi)參照)上游引物5′ -TGCATCCTGCACCAACT- 3′,下游引物5′ -CGCCTGCTTCACCACCTTC- 3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。

2.5生成、純化和鑒定hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白

2.5.1G418篩選出的CHO-K1單細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用含10%胎牛血清和500 mg/L G418的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，棄培養(yǎng)基，用PBS洗3次然后換入不含胎牛血清CHO-K1 Excel 301(JRH Biosciences)培養(yǎng)基并添加維生素K1使終濃度達(dá)1 mg/L。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基每個(gè)星期收集2次。收集的培養(yǎng)基于-20 ℃中凍存。

2.5.2hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白使用Ni-NTA樹(shù)脂(Novagen)純化，并使用離心過(guò)濾管(MWCO 10 000 Milipore)濃縮蛋白。通過(guò)親和層析純化的hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE蛋白膠檢測(cè)其純度及分子量大小。提純的蛋白于-20 ℃保存。

2.5.3純化后蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。樣品加入5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸5 min，取20 μL上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉；隨后加入鼠抗人His抗體(Novagen)，4 ℃孵育過(guò)夜；加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗，作用1 h，用TBST洗3次，每次10 min，然后用ECL顯色液顯色，并進(jìn)行曝光顯影。

2.6hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白與TF親和力檢測(cè) 以1.25 mg/L TF包被酶標(biāo)板(100 μL/well)，4℃濕盒包被過(guò)夜，第2 d 200 μL/well PBSM(PBS + 2%脫脂奶粉)37 ℃靜置封閉1 h，0.05%PBST(PBS+0.05% Tween 20)洗3次。加入0、0.01、0.1、1和10 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc，及抗TF抗體(R&D)1 mg/L，各100 μL，30 r/min結(jié)合1 h。0.05%PBST洗3次，于各樣品孔和陰性對(duì)照孔中加入鼠抗人IgG1-Fc-HRP(Vector) 100 μL 0.4 mg/L， 30 r/min結(jié)合1 h。0.05%PBST洗3次，50 μL/well TMB避光顯色20 min，50 μL/well 2 mol/L H2SO4終止，450 nm/630 nm讀A值。

2.7hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白激活NK細(xì)胞對(duì)HT-29細(xì)胞的影響 Calcein-AM的乙酸甲基脂親酯性很高，使其可以透過(guò)細(xì)胞膜，calcein-AM本身并無(wú)熒光，但在進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解成綠色熒光素calcein并滯留于細(xì)胞膜完整的細(xì)胞內(nèi)。如細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞，如在ADCC(antibody-dependent cell cytotoxicity)時(shí)，calcein釋出而被檢測(cè)[6]。 HT-29細(xì)胞96孔板體外完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度生長(zhǎng)至1×104時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。方法如下：預(yù)溫的不含鈣1×HBSS洗細(xì)胞1次，加50 μL 8 μmol/L calcein-AM ，37 ℃孵育40 min。 不含鈣HBSS液洗細(xì)胞1次，加入0 mg/L、1 mg/L和10 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白(含鈣的HBSS 含5 mmol/L CaCl2稀釋)，加入轉(zhuǎn)染了CD16的NK細(xì)胞(人源性鈕扣細(xì)胞，由耶魯大學(xué)癌癥中心胡志偉教授惠贈(zèng))作為效應(yīng)細(xì)胞至總體積200 μL HBSS液， 37 ℃ 孵育4 h。另設(shè)一空白孔不加NK細(xì)胞及提純蛋白，余步驟同前，并于該孔加裂解液20 μL (9% Triton X-100溶解于雙蒸水) 裂解細(xì)胞，孵育45 min。離心后每孔取上清100 μL 至新的96孔板作熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，熒光的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為490和515 nm。ADCC效應(yīng)評(píng)價(jià)公式：hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白組熒光值/空白孔熒光值(最大熒光標(biāo)記值)×100%。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc真核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用特異引物進(jìn)行RT-PCR，從肝組織和淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增得到目的基因片段，將其插入pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc重組載體。經(jīng)BamH I、EcoR I和XhoI三酶切，可見(jiàn)約5.4 kb、696 bp和456 bp大小的3條帶，分別為酶切后的載體片段及2條目的片段，見(jiàn)圖2。將pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc陽(yáng)性重組子進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的hFVII-LC和hIgG1-Fc序列完全吻合，且?guī)в芯幋a6×His標(biāo)簽蛋白序列,見(jiàn)圖3。說(shuō)明pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

Figure 2. Enzyme digestion identification of the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc. M:100～6 000 bp marker; 1: hFVII-LC ; 2: hIgG1-Fc ; 3:pcDNA3.1(+)- hFVII-LC+hIgG1-Fc plasmid without digestion; 4～5: pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc plasmid digested byBamH I,EcoR I andXhoI.

圖2重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc的酶切鑒定

Figure 3. Partial Chromas figure of recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc.

圖3質(zhì)粒測(cè)序圖

2RT-PCR檢測(cè)hFVII-LC+hIgG1-FcmRNA的表達(dá)

對(duì)CHO-K1-hFVII-LC+hIgG1-Fc細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出大小為456 bp的hFVII-LC條帶、大小為1 152 bp的hFVII-LC+hIgG1-Fc條帶以及大小為327 bp的GAPDH條帶，見(jiàn)圖4。在相同RT-PCR擴(kuò)增條件及加樣量下，同步轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒CHO-K1細(xì)胞無(wú)特異目的條帶。

3SDS-PAGE凝膠檢測(cè)通過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂純化后蛋白的純度和分子量大小

收集的無(wú)血清培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂純化后得到較純的目的蛋白分子量大小為55～70 kD之間。經(jīng)Western blotting檢測(cè)純化后的蛋白帶有His標(biāo)簽蛋白，見(jiàn)圖5。

4ELISA檢測(cè)hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白與TF的親和力

檢測(cè)5個(gè)不同稀釋度(0、0.01、0.1、1和10 mg/L)的hFVII-LC+hIgG1-Fc與TF的結(jié)合能力，在450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)下分別測(cè)定其A值，各平行對(duì)照孔的平均值分別為0.091、0.283、0.385、0.464和0.765。A值越大說(shuō)明合成的免疫結(jié)合物與TF的結(jié)合能力越強(qiáng)，故以上結(jié)果提示免疫結(jié)合物與TF有親和力，且呈劑量依賴性，見(jiàn)圖6。

5hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白激活NK細(xì)胞對(duì)HT-29細(xì)胞的影響

加0 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白組細(xì)胞ADCC效應(yīng)比例為9.60%±0.25%，1 mg/L和10 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白對(duì)人結(jié)直腸癌的ADCC效應(yīng)分別為47.20%±0.81%和69.60%±0.42%,ADCC效應(yīng)在1 mg/L組、10 mg/L組與0 mg/L組比較均有顯著差異(P<0.05),在0～10 mg/L范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，見(jiàn)圖7。

Figure 4. The RT-PCR for hFVII-LC+hIgG1-Fc. M：100～6 000 bp ladder marker; 1: hFVII-LC; 2: hFVII+hIgG1-Fc; 3:GAPDH; 4:negative control.

圖4RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHO-K1細(xì)胞hFVII-LC+hIgG1-FcmRNA的表達(dá)

Figure 5. Protein purification and detection. A:Ni-NTA affinity chromatography. M:protein markers,10～170 kD; 1:collected serum-free medium; 2:flow-through; 3:eluate(target protein).B:His-tag Western blotting.

圖5蛋白純化和檢測(cè)

Figure 6. The immunoconjugate identified by ELISA on tissue factor (TF) affinity and specificity.

圖6ELISA檢測(cè)hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白與TF的親和力

討 論

越來(lái)越多的研究顯示TF在多種腫瘤細(xì)胞上的特異性表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，其誘導(dǎo)的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)及與之相關(guān)的信號(hào)途徑等機(jī)制與促進(jìn)腫瘤血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)[7]，更有學(xué)者提出組織因子與腫瘤干細(xì)胞是否存在聯(lián)系[8-9]，即TF有可能是腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物。許多針對(duì)TF在腫瘤細(xì)胞上特異性表達(dá)的靶向治療如siRNA干擾腫瘤細(xì)胞TF的表達(dá)[10],或者使用組織因子特異性抗體如重組線蟲(chóng)抗凝蛋白c2(rNAPc2)[11]和Versteeg等[12]阻斷組織因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出腫瘤抑制作用。以TF為靶點(diǎn)的腫瘤靶向治療免疫交聯(lián)物hFVII-LC+hIgG1-Fc不僅可以破壞癌細(xì)胞，亦可以針對(duì)腫瘤所依賴的供應(yīng)血管從而防止腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)。Hu等[4-5]設(shè)計(jì)的抗體類似物，由編碼點(diǎn)突變(K341A)hFVII和IgG1-Fc構(gòu)成的Icon在應(yīng)用于包括黑色素瘤、前列腺癌和乳腺癌等動(dòng)物模型上時(shí)表現(xiàn)出顯著效果，使移植瘤消退，但是，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出該結(jié)合物對(duì)小鼠的凝血功能有一定影響。FVII屬于絲氨酸蛋白激酶家族成員，晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VII由輕鏈和重鏈組成，輕鏈中EGF和Gla區(qū)都與其與TF緊密結(jié)合有關(guān)，而重鏈則與凝血反應(yīng)有關(guān)[13]。作為靶向治療，靶向片段的靶向性與其分子量大小和穩(wěn)定性有重要聯(lián)系，利用TF的天然配基FVII中與TF緊密結(jié)合且不引起凝血功能異常的片段FVII-LC構(gòu)成的靶向治療免疫結(jié)合物，能達(dá)到靶向治療的目的且減少引起凝血功能異常的危險(xiǎn)。并且有研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族人的IgG-Fc基因與基因庫(kù)比較存在2個(gè)基因堿基的差異，且CH3區(qū)編碼的氨基酸不同[14]。我們之前設(shè)計(jì)的hFVII-LC+hIgG1-Fc腺病毒載體，治療結(jié)直腸癌小鼠模型體內(nèi)產(chǎn)生的hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白表現(xiàn)出與TF的親和力與hFVII一樣，且遠(yuǎn)高于TF的單克隆抗體。因而我們合成的新hFVII-LC+hIgG1-Fc免疫交聯(lián)物有如下特點(diǎn)：(1)為研究不引起機(jī)體凝血異常的以TF為靶點(diǎn)的腫瘤治療免疫結(jié)合物提供基礎(chǔ)。(2)hFVII-LC解決了點(diǎn)突變FVII分子量太大不適合于基因干預(yù)治療的問(wèn)題。(3)使用提純蛋白作為藥物可減少以腺病毒為載體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出來(lái)的肝損傷。(4)對(duì)研究 IgG效應(yīng)片段基因差異是否會(huì)影響IgG對(duì)疾病的免疫反應(yīng)性提供對(duì)比物。通過(guò)引物設(shè)計(jì)加入6×His標(biāo)簽蛋白，利于蛋白的純化和檢測(cè)，因6×His很小，在生理pH值下較穩(wěn)定，因此不改變重組蛋白的折疊結(jié)構(gòu)和生化特性，對(duì)蛋白功能幾乎沒(méi)有影響值。(5)hFVII-LC+hIgG1-Fc免疫交聯(lián)物在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞株ADCC效應(yīng)與對(duì)照組相比表現(xiàn)出顯著差異性,且ADCC效應(yīng)在0～10 mg/L范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。

圖7hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白與NK細(xì)胞混合培養(yǎng)對(duì)HT-29細(xì)胞的殺傷作用

本研究成功構(gòu)建了免疫交聯(lián)蛋白hFVII+hIgG1-Fc的真核表達(dá)載體，并獲得相關(guān)蛋白，今后我們將驗(yàn)證其體外與體內(nèi)的腫瘤治療效果。

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Constructionofanimmunoconjugatetargetingtissuefactoranditseffectoncolorectalcancercells

XU Xi1, RAO Ben-qiang2, LIANG Qi-wen2, LIU Dan1, TAN Huo1, WANG Jian-ping2, HUANG Zhen-qian1

(1TumorBloodCenter,FirstAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510230,China;2TheSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China.E-mail:huangzq2003@yahoo.com.cn)

AIM: To construct a recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc, and to produce and purify the immunoconjugate hFVII-LC+hIgG1-Fc protein.METHODSThe target sequences were amplified by RT-PCR from hepatic tissue and lymphocyte RNA, and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing, the recombinant plasmid was transfected into CHO-K1 cells by lipofectamine 2000. The transfectant clones were selected by G418 screening. The positive monoclonals were grown in CHO-K1 serum-free medium Excel 301 and the culture medium was collected. The hFVII-LC+hIgG1-Fc protein was purified by affinity Ni-NTA resin. The immunoconjugate was identified by ELISA with tissue factor (TF) affinity and specificity. Induction of NK cell-mediated antibody-dependent cell cytotoxicity(ADCC) was examined in HT-29 colorectal cancer cell line.RESULTSHuman liver tissue and lymphocytes from Han population were used as template for amplification of hFVII-LC and hIgG1-Fc DNA fragments, which were confirmed by sequencing and were exactly the same as those GenBank reported. The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc was successfully constructed, and 1.3 mg of hFVII-LC+hIgG1-Fc protein could be prepared from 1 liter of Excel 301 serum-free culture medium through Ni-NTA affinity chromatography. The immunoconjugate was specially bound to TF and induced a significant ADCC response in HT-29 cells.CONCLUSIONThe human hFVII-LC+hIgG1-Fc recombinant plasmid and the hFVII-LC+hIgG1-Fc immunoconjugate are obtained, which provide the basis for further study of cancer-targeted therapy.

Tumor targeted therapy; Tissue factor; Immunoconjugate； CHO-K1 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.007