程 帝， 李志花△， 陳汝福， 郭 寧， 廖巧芳， 鄭禮平， 周泉波， 周嘉嘉

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院 1腫瘤科，2肝膽外科，廣東 廣州 510120)

1000-4718(2012)03-0415-05

2011-10-31

2012-01-09

國家自然科學基金資助項目(No.30872485)

△通訊作者Tel:020-81332107；E-mail: chenrf63@163.com

上調(diào)SMYD3對人膽管癌FRH0201細胞中DNMT3B表達及細胞增殖的影響*

程 帝1， 李志花1△， 陳汝福2， 郭 寧2， 廖巧芳1， 鄭禮平1， 周泉波2， 周嘉嘉2

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院1腫瘤科，2肝膽外科，廣東 廣州 510120)

目的研究人膽管癌細胞株FRH0201中SET和MYND結構域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3，SMYD3)過度表達對DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3B(DNA methyltransferase 3B，DNMT3B)表達及細胞增殖能力的影響。方法瞬時轉(zhuǎn)染SMYD3真核表達質(zhì)粒后， RT-PCR檢測細胞中DNMT3B mRNA水平的變化；Western blotting檢測細胞中DNMT3B蛋白水平的變化；CCK-8檢測細胞增殖能力的改變；流式細胞術檢測細胞周期的改變。結果以未處理組為對照，膽管癌細胞FRH0201在轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒后，DNMT3B蛋白及mRNA表達均顯著上升(P<0.01)；細胞的增殖能力顯著提高、細胞增殖速度加快(P<0.05)；進入G2/M期的細胞明顯增多(P<0.05)。結論過度表達SMYD3，可引起細胞中DNMT3B的表達上調(diào)并增強細胞增殖能力。

FRH0201細胞； 甲基化； 組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶； DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶

SET和MYND結構域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3，SMYD3)是一種具有組蛋白H3-K4特異性甲基化活性的甲基化轉(zhuǎn)移酶。SMYD3可特異性結合下游靶基因啟動子區(qū)域5′-CCCTCC-3′序列，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，上調(diào)靶基因的表達[1]。研究發(fā)現(xiàn)，SMYD3在結腸癌、肝癌、乳腺癌及肝門部膽管癌中均呈現(xiàn)過表達[1-3]。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3B(DNA methyltransferase 3B，DNMT3B)是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，表現(xiàn)出從頭甲基化的作用。DNMT3B在正常的成體細胞中豐度較低，主要存在于胚胎細胞及腫瘤細胞中[4-5]。本研究通過上調(diào)細胞中SMYD3的表達，探討過度表達的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD3能否引起DNMT3B的表達上調(diào)，及對肝門部膽管癌細胞增殖活性的影響。

材 料 和 方 法

1材料

人肝門部膽管癌細胞株FRH0201由山東大學齊魯醫(yī)院吳小鵬教授惠贈；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自Gibco；脂質(zhì)體Lipofectamine LTX with Plus Reagent購自Invitrogen；SMYD3真核表達質(zhì)粒pEGFP-C3-SMYD3由本實驗室構建；SMYD3兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz；DNMT3B兔抗人多克隆抗體購自Abcam；總RNA 提取試劑Trizol購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑購自TaKaRa；CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將FRH0201細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，取對數(shù)生長期細胞消化、重懸，調(diào)整單細胞懸液的細胞密度為5×108cells/L，以2 mL/well細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中。待細胞生長24h后，細胞匯合度約70%時開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h更換新鮮培養(yǎng)基。取2.5 μg質(zhì)粒DNA溶于500 μL Opti MEM中，混勻；取2.5 μL Plus混勻于Opti MEM-質(zhì)粒DNA混合液中，靜止5 min；取7.5 μL LTX混勻于Opti MEM-質(zhì)粒DNA-Plus混合液中，靜止30 min；最后將Opti MEM-質(zhì)粒DNA-Plus-LTX預混液加入各孔培養(yǎng)液中，混勻。轉(zhuǎn)染后8 h更換新鮮培養(yǎng)基。實驗設計分3組：未處理組、轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體組、轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒組。

2.2RT-PCR檢測SMYD3、DNMT3B的mRNA表達 轉(zhuǎn)染后24 h，Trizol法抽提細胞總RNA。按照RT-PCR試劑操作說明合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應。SMYD3上游引物5′-TGGCAAACTGCAGCTACATCAAG-3′，下游引物5′-CTGATGTTGGCGTCGCATTC-3′，產(chǎn)物為150 bp；DNMT3B上游引物5′-GGCCACCTTCAATAAGCTCGTC-3′，下游引物5′-CCACTCCAACATGGGCTTCA-3′，產(chǎn)物為139 bp；β-actin上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′- CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，產(chǎn)物為186 bp。PCR反應參數(shù)：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)拍攝并分析結果。

2.3Western blotting 檢測SMYD3、DNMT3B的蛋白表達 轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制8% SDS-PAGE凝膠，各上樣孔加入30 μg定量后的蛋白樣品，60 V電泳30 min，100 V電泳90 min。300 mA轉(zhuǎn)膜120 min。將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜置于50 g/L的脫脂奶粉中封閉2 h。然后分別加入SMYD3 兔抗人多克隆抗體(1∶400)、DNMT3B兔抗人多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌10 min，重復3次后。再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌10 min，重復3次。最后用ECL顯影，膠片曝光。掃描膠片成像，圖片經(jīng)Quantity One軟件分析灰度值。取SMYD3、DNMT3B與tubulin灰度值之比作為蛋白的相對表達量。

2.4CCK-8檢測細胞增殖能力變化 取對數(shù)生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×106cells/L，以100 μL/well細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中。置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞匯合度約70%時，開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程中，Opti MEM、質(zhì)粒DNA、Plus、LTX的使用劑量分別調(diào)整為：20 μL、0.1 μg、0.1 μL、0.3 μL，其余操作步驟同“2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染”。實驗分為3組：未處理組、轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體組、轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒組。分別在轉(zhuǎn)染8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h后，更換為不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基，并向每孔加入10 μL CCK-8溶液。37 ℃孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A值)。計算細胞增殖率，細胞增殖率(%)=(處理組孔A值-空白孔A值)/(對照組孔A-空白孔A)×100%。

2.5流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率、分析細胞周期 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為5×108cells/L，以2 mL/well單細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染前6 h，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，使各孔細胞的細胞周期同步化。其余轉(zhuǎn)染步驟同“2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染”。轉(zhuǎn)染24 h后，用胰酶消化收集細胞，PBS洗2遍，離心后棄上清，加入1 mL 70%預冷乙醇，吹打均勻，4 ℃固定過夜。上機前離心收集細胞，PBS洗滌，用含RNA酶的1%碘化丙啶(propidium iodide,PI，Sigma)染色30 min。采用流式細胞儀檢測分析細胞周期。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1SMYD3對DNMT3BmRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示：轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒組的SMYD3及DNMT3B mRNA表達水平均較未處理組明顯升高，吸光度比值分別為6.721±0.105和4.105±0.093，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體組與未處理組的SMYD3及DNMT3B mRNA表達水平則無明顯差異，吸光度比值分別為1.180±0.043和1.007±0.047，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

2SMYD3對DNMT3B蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示：轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒組的SMYD3及DNMT3B 蛋白表達水平較未處理組明顯升高，灰度比值分別為1.708±0.102和2.547±0.114，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體組與未處理組的SMYD3及DNMT3B 蛋白表達水平則無明顯差異，灰度比值分別為0.915±0.077和1.002±0.102，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 1. Effect of SMYD3 over-expression on expression of DNMT3B mRNA.1,4: non-treatment; 2,5: empty plasmid; 3,6: SMYD3 plasmid.**P<0.01vsnon-treatment.

圖1SMYD3對DNMT3BmRNA表達的影響

Figure 2. Effect of SMYD3 over-expression on expression of DNMT3B protein.**P<0.01vsnon-treatment.

圖2SMYD3對DNMT3B蛋白表達的影響

3SMYD3對細胞生長曲線的影響

CCK-8檢測細胞生長曲線，結果顯示：轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒的FRH0201細胞生長曲線較陡，斜率較大。20～40 h，吸光度值始終顯著高于未處理組的細胞，細胞增殖能力顯著強于未處理組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體的FRH0201細胞則與未轉(zhuǎn)染細胞無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of SMYD3 over-expression on proliferation of FRH0201 cells.*P<0.05vsnon-treatment.

圖3SMYD3對細胞增殖能力的影響

4SMYD3對細胞周期的影響

流式細胞儀分析顯示：以未處理組細胞G2/M期[(8.40±1.78)%]為對照，轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒的細胞有(36.84±2.72)%進入了G2/M期，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體的細胞進入G2/M期僅有(9.18±1.58)%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。這表明SMYD3對細胞增殖及細胞周期的影響主要是通過縮短S 期并促進細胞從S期向G2期過渡實現(xiàn)的。

Figure 4. Effect of SMYD3 over-expression on cell cycle of FRH0201 cells.*P<0.05vsnon-treatment.

圖4SMYD3對細胞周期的影響

討 論

腫瘤抑制基因的異常甲基化是腫瘤發(fā)生過程中的顯著特征，DNMT3B在腫瘤組織中表達豐度異常升高，過表達的DNMT3B可引起腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域CpG島異常甲基化，導致腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄失活[4, 6]；而下調(diào)DNMT3B在腫瘤細胞中的表達，可促進腫瘤的凋亡[7]。這說明DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的過度表達可促進細胞生物學行為惡性化、維持癌細胞永生化?；蚣谆揎椀牧硪粋€重要因素——組蛋白甲基化是染色質(zhì)結構改變和基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控機制[8-9]。SMYD3可特異性結合下游靶基因啟動子區(qū)域5′-CCCTCC-3′序列，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，上調(diào)靶基因的表達[1]。通過軟件分析發(fā)現(xiàn)，DNMT3B基因啟動子區(qū)域存在4個以上5′-CCCTCC-3′重復序列，這為SMYD3直接調(diào)節(jié)DNMT3B基因的轉(zhuǎn)錄、表達提供可能性。本研究結果顯示：以未處理組為對照，膽管癌細胞FRH0201在轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒后，DNMT3B蛋白及mRNA表達均顯著上升；而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體的細胞與未處理組之間沒有明顯差異。這一結果說明，上調(diào)SMYD3表達可以提高細胞中DNMT3B蛋白的表達豐度。SMYD3可能通過特異性結合DNMT3B基因啟動子區(qū)域5′-CCCTCC-3′序列，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。

SMYD3通過其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，直接或間接改變原癌基因(c-met、c-jun、Wnt10B等)、細胞周期調(diào)節(jié)基因(CDK2、DNA拓撲異構酶Ⅱβ等)、信號轉(zhuǎn)導相關基因(RAB40C、GnRF2等)在細胞中的表達量[1,10-11]。過度表達的SMYD3通過對上述一系列基因的異常調(diào)節(jié)，促進細胞增殖及細胞永生化[12-13]。本研究中，CCK-8檢測細胞生長曲線顯示：以未處理組為對照，膽管癌細胞FRH0201在轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒后，細胞的增殖能力顯著提高，增殖速度加快。而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體的細胞與未處理組之間沒有明顯差異。細胞周期是細胞生命活動的基本過程，主要分為4個時期：G1期、S期、G2期和M期。在細胞周期中，細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)2對細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換及S期的進程具有十分重要的作用；DNA拓撲異構酶Ⅱβ通過調(diào)節(jié)DNA空間拓撲結構，在DNA復制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SMYD3的高度表達將導致CDK2和DNA拓撲異構酶Ⅱβ表達上調(diào)[1]。這與本研究中的細胞周期結果一致：轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-SMYD3質(zhì)粒后，進入G2/M期的細胞較未處理組明顯增多；而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空白載體的細胞與未處理組之間沒有明顯差異。這說明SMYD3 對細胞增殖及細胞周期的影響主要是通過縮短S 期并促進細胞從S期向G2期的過渡實現(xiàn)的。

綜上所述，SMYD3過度表達可引起DNMT3B的表達升高、細胞增殖能力增強及細胞周期的改變。SMYD3對DNMT3B的表達調(diào)節(jié)機制可能為：過度表達的SMYD3通過結合DNMT3B基因啟動子區(qū)域5′-CCCTCC-3′序列，上調(diào)DNMT3B的轉(zhuǎn)錄活性，使DNMT3B的表達水平上升。DNMT3B也可能參與了SMYD3對細胞增殖及細胞周期的調(diào)節(jié)。

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EffectofSMYD3over-expressiononDNMT3BlevelsandproliferationabilityinhumancholangiocarcinomacelllineFRH0201

CHENG Di1, LI Zhi-hua1, CHEN Ru-fu2, GUO Ning2, LIAO Qiao-fang1, ZHENG Li-ping1, ZHOU Quan-bo2, ZHOU Jia-jia2

(1DepartmentofOncology,2DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:chenrf63@163.com)

AIM: To explore the effect of SET and MYND domain-containing protein 3 (SMYD3) over-expression on the expression of DNA methyltransferase 3B (DNMT3B) and the proliferation ability in human cholangiocarcinoma cell line FRH0201.METHODSTransient transfection of SMYD3 eukaryotic expression plasmid pEGFP-C3-SMYD3 into human cholangiocarcinoma cell line FRH0201 was performed. The expression of DNMT3B at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and Western blotting,respectively. Cell proliferation was examined by CCK-8 method and cell cycle situation was checked by flow cytometry.RESULTSAfter transfected with SMYD3 eukaryotic expression plasmid pEGFP-C3-SMYD3, the over-expression of SMYD3 in FRH0201 cells was observed. Compared with the untransfected cells, the expression of DNMT3B was significantly increased (P<0.01), the proliferation rate was obviously accelerated (P<0.05) and the number of the cells in G2/M phase was significantly increased (P<0.05) in FRH0201 cells transiently transfected with pEGFP-C3-SMYD3 plasmid.CONCLUSIONThe transient transfection of pEGFP-C3-SMYD3 plasmid induces over-expression of DNMT3B and promotes the proliferation of human cholangiocarcinoma cell line FRH0201.

FRH0201 cells; Methylation; Histone methyltransferase; DNA methyltransferase

R735.8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.006