梁世楨， 王國軒， 范龍坤， 吳高義， 金 巖， 朱國雄△

(1遼寧醫(yī)學(xué)院濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地口腔科，山東 濟(jì)南 250031；2遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院, 遼寧 錦州 121001；3濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院口腔科，山東 濟(jì)南 250031；4第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032)

1000-4718(2012)03-0398-06

2011-10-19

2011-12-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2011CB964700)

△ 通訊作者Tel：0531-51665340；E-mail：jnjqzgx@163.com

# 現(xiàn)工作單位：濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院口腔科,山東 濟(jì)南 250031

去勢大鼠骨量丟失過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化功能*

梁世楨1#， 王國軒2， 范龍坤2， 吳高義3， 金 巖4， 朱國雄3△

(1遼寧醫(yī)學(xué)院濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地口腔科，山東 濟(jì)南 250031；2遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院, 遼寧 錦州 121001；3濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院口腔科，山東 濟(jì)南 250031；4第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032)

目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖分化功能在去勢大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中對(duì)骨量丟失的作用。方法選用10周齡健康雌性SD大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)，建立骨質(zhì)疏松癥(OP)的動(dòng)物模型；選用同一批次、周齡相同、體重相近的健康雌性SD大鼠行雙側(cè)卵巢附近脂肪組織部分切除術(shù)，建立假手術(shù)(sham)組，假手術(shù)大鼠組(sham group)。采用離心法、貼壁法和有限稀釋法分離、培養(yǎng)、純化大鼠BMSCs，體外培養(yǎng)傳至3～4代后用于實(shí)驗(yàn)：流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行BMSCs表型鑒定；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測BMSCs增殖狀況；MTT法測定BMSCs生長曲線；成脂誘導(dǎo)后脂滴油紅O染色法檢測比較2組大鼠BMSCs成脂能力；成骨誘導(dǎo)后鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色法檢測比較2組大鼠BMSCs成骨能力；RT-PCR法檢測大鼠BMSCs成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2、骨鈣素(OCN)和骨橋蛋白(OPN)mRNA的表達(dá)。結(jié)果與sham組大鼠BMSCs相比，OVX組大鼠BMSCs克隆形成能力減弱，增殖能力降低，成脂向分化增強(qiáng)，成骨向分化減弱(P<0.05)。結(jié)論去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs增殖及成骨分化減弱，成脂分化增強(qiáng)；這導(dǎo)致去勢大鼠快速的骨量丟失，在去勢大鼠OP發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 卵巢切除術(shù)；大鼠； 骨生成; 脂肪形成

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量丟失為重要特征的骨代謝疾病，在絕經(jīng)后婦女中發(fā)病率較高。研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在OP的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[1]。BMSCs存在于骨髓，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，適宜條件下可分化再生骨、軟骨、脂肪等間充質(zhì)組織。研究表明OP的發(fā)生與BMSCs增殖和分化能力的改變有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中，OP患者來源的BMSCs增殖能力較正常人來源的差[2]；OP的發(fā)生與BMSCs成骨分化能力的下降有重要關(guān)系[3]；絕經(jīng)后OP發(fā)病過程中骨量丟失時(shí)常伴有骨髓中脂肪組織的增加[4]；骨髓腔內(nèi)的脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞均來源于BMSCs，二者具有相同的細(xì)胞表型，在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)換，并且存在彼消此長的關(guān)系[5]。本文旨在通過比較去勢(ovariectomized，OVX)后OP模型大鼠與假手術(shù)(sham)大鼠BMSCs增殖及成骨、成脂向分化能力的改變，從細(xì)胞學(xué)的角度研究BMSCs增殖、成骨及成脂分化三因素的聯(lián)合作用在OVX組大鼠OP發(fā)病過程中對(duì)骨量丟失的重要作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 同一批次的健康10周齡SD大鼠24只，雌性，體重(210±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑 低糖α-MEM培養(yǎng)液(alpha modified Eagle’s medium，Gibco)，胎牛血清(Gibco)，β-甘油磷酸鈉(glycerophosphate，GP，Sigma)，地塞米松(dexamethasoned，Dex， Sigma)，維生素C(vitamin C，Vit C,Sigma)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methyl xanthine，IBMX，Sigma)，吲哚美辛(Sigma)，胰島素(萬邦制藥)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa)。

1.3主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，倒置相差顯微鏡(Olympus)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)等。

2方法

2.1OP動(dòng)物模型建立[6]與分組 24只10周齡健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組12只。一組大鼠行去勢即雙側(cè)卵巢切除術(shù)，去勢后3月，即可成功構(gòu)建OP的動(dòng)物模型，為OVX組；另一組大鼠行雙側(cè)卵巢附近脂肪組織部分切除術(shù)，建立假手術(shù)(sham)組，作為對(duì)照。所有動(dòng)物均在24～28 ℃、通風(fēng)良好的相同條件下飼養(yǎng)，自由攝水食。

2.2BMSCs體外分離培養(yǎng)純化 術(shù)后3月，分別將OVX組與sham組大鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡10 min，取出后無菌條件下分離大鼠股骨，去除附著的肌肉、骨膜等軟組織，切除兩側(cè)干骺端，5 mL注射器吸取含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的α-MEM培養(yǎng)液吹出骨髓，吹打均勻后，800 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液重懸，吹打均勻，將原代BMSCs接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，第4 d首次半量換液，棄懸浮細(xì)胞，以后每隔1 d全換液1次。

2.3BMSCs的傳代 待細(xì)胞融合生長達(dá)培養(yǎng)瓶底壁80%～90%時(shí)，棄去舊的培養(yǎng)液，PBS(phosphate buffered saline)清洗2遍，加入2～3 mL胰酶，培養(yǎng)箱中消化1～2 min。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞收縮成圓形、懸浮后，加入3～4 mL含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液終止消化，吹勻，移入10mL離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液重懸，吹打均勻，以1∶2接種于新培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳至3～4代后細(xì)胞純化率較高，生長狀態(tài)較好，用于實(shí)驗(yàn)。

2.4BMSCs細(xì)胞表型鑒定 將生長狀態(tài)較好的P3代細(xì)胞消化后，用含3%FBS的PBS清洗1次后重懸，分別加入不同標(biāo)記的抗體：CD29、CD34、CD44(PE標(biāo)記)和CD45(FITC標(biāo)記)[7]，4 ℃避光1 h，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用含3%FBS的PBS清洗2次，再次重懸，分別以PE、FITC標(biāo)記作為陰性對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測。

2.5BMSCs細(xì)胞增殖狀況 取P3代細(xì)胞常規(guī)消化，離心，重懸后計(jì)數(shù)，以2 000個(gè)細(xì)胞 /皿，接種于直徑10 cm平皿，補(bǔ)加培養(yǎng)液至10 mL，十字形晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分散，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2周，PBS清洗2遍，多聚甲醛6 mL室溫固定30 min，PBS再次清洗2遍，10 g/L甲苯胺藍(lán)PBS溶液染色，計(jì)數(shù)克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100% 。

2.6生長曲線 取P3代細(xì)胞常規(guī)消化、離心、計(jì)數(shù)，以2 000 cells/well、180 μL /well設(shè)置7組，每組7孔(6個(gè)復(fù)孔，1個(gè)對(duì)照孔)接種于96孔板，接種24 h后，加入3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)液5 μL /well(MTT液配制：5 g MTT/L PBS液)，置于培養(yǎng)箱中4 h后，棄去舊的液體，加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL /well，微孔板振蕩器振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀選取490 nm測定吸光度值(A)，以后每隔24 h檢測1組，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制生長曲線。

2.7BMSCs成脂向誘導(dǎo) 取P3代細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于6孔板，待細(xì)胞完全融合后，加入成脂誘導(dǎo)液(配置250 mL誘導(dǎo)液：含10%FBS的 α-MEM培養(yǎng)液250 mL+吲哚美辛8.9445 g+IBMX 27.8 g+1 g/L胰島素500 μL+39.1 g/L Dex 250 μL)[8]2～3 mL/well，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，誘導(dǎo)14 d。

2.8BMSCs成脂誘導(dǎo)后油紅O染色 細(xì)胞成脂誘導(dǎo)14 d后，PBS清洗2遍，多聚甲醛2 mL/well，室溫固定30 min，PBS清洗2遍，5 g/L油紅異丙醇溶液以去離子水按3∶2 稀釋、過濾后染色，室溫1 h，PBS清洗2遍，照相。

2.9BMSCs成脂向誘導(dǎo)定量檢測 細(xì)胞成脂誘導(dǎo)染色后，PBS清洗2遍，加異丙醇溶脂，酶標(biāo)儀570 nm檢測A值。

2.10BMSCs成骨向誘導(dǎo) 取P3代細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于6孔板，待細(xì)胞融合80%后，加入成骨誘導(dǎo)液(配置250 mL誘導(dǎo)液：含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液250 mL+GP 0.815 g+30 g/L Vit C 417 μL+0.002 g/L Dex 50μL)2 mL /well，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，誘導(dǎo)14 d。

2.11BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色法(ARS) 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后，PBS清洗2遍，多聚甲醛2 mL/well，室溫固定30 min，PBS清洗2遍，加入茜素紅染液(1 g Tris+100 mL去離子水，加HCl調(diào)pH至8.0，加入0.1 g茜素紅粉劑，混勻、過濾)，培養(yǎng)箱中染色1 h，PBS清洗2遍、照相。

2.12BMSCs成骨向誘導(dǎo)定量檢測 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)染色后，PBS清洗2遍，加Tris·HCl(pH 5.6)，鈣結(jié)節(jié)溶解后，酶標(biāo)儀405 nm檢測A值。

2.13RT-PCR檢測BMSCs成骨誘導(dǎo)后骨鈣素(osteocalcin，OCN)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2) mRNA的表達(dá) (1)成骨誘導(dǎo)14 d后，用Trizol法(Invitrogen)按說明書提取總RNA；(2)取總RNA2.0 μg，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，逆轉(zhuǎn)錄體系(50 μL)：5×PrimeScript Buffer(for real-time)10 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ2.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)2.5 μL，Random 6-mers(100 μmol/L)2.5 μL，Total RNA，補(bǔ)加RNase free dH2O至50 μL，按說明書合成cDNA；(3)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系(20 μL)：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10μL，ROX reference dyeⅡ(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，PCR forward primer(10 μmol/L)0.5 μL，PCR reverse primer(10 μmol/L)0.5 μL，dH2O 6.6 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95℃ 15 s,60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。所用引物采用Oligo 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì),由上海英駿生物公司合成。β-actin上游引物5’-CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG C-3’，下游引物5’-GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T-3’，擴(kuò)增片段長度692 bp；Runx2上游引物5’-CCA CCT CTG ACT TCT GCC TC-3’，下游引物5’-TAT GGA GTG CTG CTG GTC TG-3’，擴(kuò)增片段長度298 bp；OCN上游引物5’-AGC GAC TCT GAG TCT GAC AAA-3’，下游引物5’-AAC GGT GGA GCC ATA GAT GCG-3’，擴(kuò)增片段長度221 bp；OPN上游引物5’-AGA GAG CAA CGG GAA GAC-3’，下游引物5’-ATG GAA CTC GCC TGA CTG-3’，擴(kuò)增片段長度207 bp。PCR擴(kuò)增后，得到OVX組與sham組β-actin、Runx2、OCN與OPN mRNA檢測結(jié)果Ct值：ΔCt=Ct-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCtOVX-ΔCtsham，mRNA相對(duì)表達(dá)水平即為2-ΔΔCt。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1BMSCs細(xì)胞表型鑒定

P3代BMSCs表型鑒定如圖1所示，表型分子CD29和CD44陽性率分別為97.1%和94.0%，CD34和CD45陽性率分別為0.2%和3.1%。

2BMSCs增殖

克隆形成染色如圖2所示，與sham組相比，OVX組大鼠BMSCs增殖形成的肉眼可見的克隆較少，較稀疏，單克隆較小。定量分析，OVX組大鼠BMSCs克隆形成率較sham組降低約19%，見表1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鏡下觀察單克隆細(xì)胞形態(tài)，顯示OVX組大鼠BMSCs與sham組相比，細(xì)胞較為寬大、扁平，細(xì)胞多呈裂解狀態(tài)。

3BMSCs生長曲線

生長曲線如圖3所示，從第1～3 d，OVX組BMSCsA值與sham組相比，無明顯差異；從第4 d開始，sham組BMSCs較OVX組BMSCs曲線升高明顯，OVX組BMSCs活性減弱，細(xì)胞生長速度減慢，2組比較差異顯著(P<0.05)。

Figure 1. Phenotypes of rat BMSCs observed by FCM.

圖1大鼠BMSCs細(xì)胞表型鑒定

Figure 2. Colony formation and monoclonal morphology of rat BMSCs.A:colony formation of BMSCs in sham group;B:colony formation of BMSCs in OVX group;C:monoclonal morphology of BMSCs in sham group(×40);D:monoclonal morphology of BMSCs in OVX group(×40).

圖2大鼠BMSCs克隆形成及單克隆形態(tài)

表1OVX組與sham組BMSCs克隆形成率、成脂及成骨分化能力的定量分析

GroupCFE(%)AADIAOSISham0.160±0.0082.238±0.1331.995±0.174OVX0.130±0.006*3.059±0.122*1.215±0.073*

*P<0.05vssham group.

Figure 3. Growth curves of rat BMSCs in sham group and OVX group.*P<0.05vssham group.

圖3Sham組與OVX組大鼠BMSCs生長曲線

4BMSCs成脂誘導(dǎo)染色及定量

鏡下觀察， sham組BMSCs成脂誘導(dǎo)染色后，脂滴較少，與sham組相比，OVX組脂滴紅亮，數(shù)量明顯增多，見圖4。定量檢測， OVX組BMSCs成脂能力較sham組明顯增強(qiáng)，A值增加約27%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Figure 4. Oil red O dyeing after adipogenic induction of rat BMSCs in sham and OVX groups(×200).A:sham group;B:OVX group.

圖4Sham組與OVX組大鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)油紅O染色

5BMSCs成骨誘導(dǎo)染色及定量

鏡下觀察，與sham組比較，OVX組鈣化結(jié)節(jié)形成數(shù)量明顯減少，見圖5。定量檢測， OVX組BMSCs成骨能力較sham組明顯減弱，A值降低約39%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Figure 5. Alizarin red staining after osteogenic induction of rat BMSCs in sham and OVX groups(×100).A:sham group;B:OVX group.

圖5Sham組與OVX組大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)茜素紅染色

6BMSCs成骨誘導(dǎo)后OCN、OPN、Runx2mRNA表達(dá)的比較

如圖6所示，成骨誘導(dǎo)14 d后，與sham組比較，OVX組BMSCs OCN、OPN和Runx2 mRNA表達(dá)均顯著降低，其中Runx2降低最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示OVX組BMSCs成骨向分化能力較sham組降低。

圖6Sham組與OVX組成骨誘導(dǎo)后Runx2、OCN和OPNmRNA表達(dá)的比較

討 論

OP是以骨量丟失以及骨組織的退變?yōu)樘卣鞯囊环N全身性骨代謝疾病，高發(fā)于老年人和絕經(jīng)后婦女。隨著人口老齡化社會(huì)的到來，OP已成為嚴(yán)重危害人類健康的世界范圍的公共衛(wèi)生問題。研究表明，BMSCs是存在于骨髓中的干細(xì)胞群體，維持骨發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡，其在OP發(fā)病途徑中發(fā)揮著重要作用。

BMSCs不具有特異性的表面抗原，CD29、CD44、CD105是其重要表型分子，因其不表達(dá)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)表面抗原，如CD34、CD45，因此本實(shí)驗(yàn)采用CD29、CD34、CD44、CD45作為BMSCs鑒定的參考分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示指標(biāo)CD29和CD44表達(dá)陽性，指標(biāo)CD34和CD45表達(dá)陰性，符合BMSCs表型特征。陽性指標(biāo)CD29和CD44陽性率分別為97.1%和94.0%，表明實(shí)驗(yàn)所用P3代BMSCs純化率在94.0%以上。

實(shí)驗(yàn)通過克隆形成和MTT生長曲線檢測比較OVX組與sham組大鼠BMSCs增殖能力及倍增速度。克隆形成實(shí)驗(yàn)通過克隆形成率及克隆大小兩個(gè)指標(biāo)反應(yīng)細(xì)胞增殖狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVX組BMSCs克隆形成率低于sham組，OVX組BMSCs單克隆與sham組相比較小，且單克隆中單個(gè)干細(xì)胞生長狀態(tài)較差，表明OVX組BMSCs較sham組增殖減弱。MTT生長曲線上，從總體趨勢來看，OVX組曲線斜率小于sham組,其BMSCs倍增時(shí)間長于sham組，表明OVX組BMSCs增長速度降低。實(shí)驗(yàn)表明，從單個(gè)細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞群體倍增時(shí)間兩個(gè)方面來看，OVX組BMSCs增殖活性明顯降低。研究表明，OP模型小鼠中，小鼠BMSCs增殖能力下降時(shí)，成骨能力減弱[9]。BMSCs增殖受到抑制時(shí)，可致去勢大鼠快速骨量丟失[10]。

不同誘導(dǎo)條件下，BMSCs可向成骨細(xì)胞或成脂細(xì)胞分化[11]。本實(shí)驗(yàn)中，BMSCs成脂向誘導(dǎo)后，鏡下可見有成串脂滴形成，經(jīng)油紅O染色，形成圓形光亮橙紅色脂滴，表明干細(xì)胞成脂向誘導(dǎo)成功。鈣化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞分泌膠原結(jié)合鈣鹽而成，是鑒定干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志。BMSCs成骨向誘導(dǎo)后，經(jīng)茜素紅染色成紅褐色陽性鈣化結(jié)節(jié)，表明干細(xì)胞成骨向誘導(dǎo)成功。OCN及OPN是BMSCs誘導(dǎo)成骨后的關(guān)鍵指標(biāo)，反映成骨細(xì)胞的活性，在OP時(shí)OCN及ONP水平均有下降。Runx2是成骨細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子，可通過結(jié)合成骨細(xì)胞特異性元件[12]，調(diào)控OPN和OCN基因的表達(dá)，合成蛋白，實(shí)現(xiàn)骨形成。RT-PCR結(jié)果顯示，去勢后，成骨相關(guān)蛋白的mRNA水平均下調(diào)。

研究認(rèn)為，OP的發(fā)生是干細(xì)胞成骨成脂分化能力不平衡[13]。研究發(fā)現(xiàn)OP患者BMSCs成骨分化能力減弱，成脂分化能力增強(qiáng)[3]。本實(shí)驗(yàn)表明，大鼠去勢后，與sham組相比，OVX組大鼠BMSCs成脂能力明顯增強(qiáng)，成骨能力明顯減弱。OVX組大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后，成骨標(biāo)志性基因及蛋白如Runx2、OCN、OPN mRNA表達(dá)均有顯著降低。在一定條件下，BMSCs成脂成骨向分化可以相互轉(zhuǎn)化，且存在此消彼長關(guān)系[5]，BMSCs成骨分化減弱時(shí)，可致去勢大鼠癥狀加重或快速骨量丟失[10]。本實(shí)驗(yàn)中，OVX組大鼠BMSCs成骨向分化明顯減弱，成脂向分化增強(qiáng)，同時(shí)也意味著成骨向分化的進(jìn)一步減弱，在去勢后大鼠骨量丟失過程中發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)通路Wnt /β-catenin經(jīng)典通路調(diào)節(jié)并促進(jìn)BMSCs增殖，促進(jìn)BMSCs成骨向分化，抑制BMSCs成脂向分化[14]。Wnt /β-catenin信號(hào)通路通過β-catenin/Tcf-1介導(dǎo)的成骨性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的活化促進(jìn)骨的形成[15]。本實(shí)驗(yàn)采用去勢大鼠與假手術(shù)大鼠比較，消除了去勢時(shí)手術(shù)對(duì)大鼠的刺激因素，更好地顯示去勢后大鼠BMSCs增殖分化功能的改變；實(shí)驗(yàn)表明，去勢大鼠BMSCs可能通過信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的抑制，降低其增殖及成骨向分化功能，增強(qiáng)成脂向分化功能，從而引起去勢大鼠快速的骨量丟失；此三因素在去勢后大鼠骨量丟失過程中聯(lián)合作用，共同發(fā)揮著重要作用。

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Proliferationanddifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsinprocessofbonelossinovariectomizedrats

LIANG Shi-zhen1, WANG Guo-xuan2, FAN Long-kun2, WU Gao-yi3, JIN Yan4, ZHU Guo-xiong3

(1DepartmentofStomatology,JinanMilitaryGeneralHospital,PostgraduateTrainingBaseofLiaoningMedicalUniversity,Jinan250031,China;2PostgraduateCollege,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China;3DepartmentofStomatology,JinanMilitaryGeneralHospital,Jinan250031,China;4SchoolofStomatology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:jnjqzgx@163.com)

AIM: To study the function of proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) for bone loss in the pathogenesis of osteoporosis (OP) in ovariectomized rats.METHODSAnimal model of OP was established by ovariectomy (OVX,bilateral ovarian resection) in 10-week-old healthy female Sprague-Dawley (SD) rats.BMSCs were isolated, cultured and purified by the combination of density gradient centrifugation, adhesion separation and limited dilution method, and culturedinvitroto the 3rd～4th passage in all experiments. The BMSCs phenotype appraisal was studied by flow cytometry. Colony-forming assay was applied to detect the BMSCs proliferation ability. The MTT method was used to analyze the growth curves of BMSCs. After adipogenic induction (ADI), lipid drops were observed by oil red O staining to compare the adipogenic potential between the 2 kinds of BMSCs. After osteogenic induction (OSI), calcium nodules were observed by alizarin red staining (ARS). The mRNA expression levels of BMSCs osteogenesis-related proteins, for instance, Runx2, osteocalcin (OCN) and osteopontin (OPN) were measured by RT-PCR.RESULTSCompared with sham group, the colony-forming ability of BMSCs in OVX group became decreased, the proliferation capacity was declined, the osteogenic potential was decreased, and the adipogenic potential was increased(P<0.05).CONCLUSIONIn ovariectomized OP rats, the proliferation and osteogenesis of BMSCs decrease, and the adipogenesis of BMSCs increases, which may cause rapid bone loss and play an important role in the pathogenesis of OP.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Ovariectomy; Rats; Osteogenesis; Adipogenesis

R361+.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.003