宋海巖， 鄧曉慧， 苗瑩瑩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

1000-4718(2012)04-0742-04

2011-10-14

2011-12-05

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院高層次人才科研基金資助項(xiàng)目(No.08SSKYQD-001)

△ 通訊作者Tel: 0373-3029051；E-mail：shy80825@yahoo.com.cn

Humanin通過抑制一氧化氮發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用*

宋海巖△， 鄧曉慧， 苗瑩瑩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的探討humanin (HN)拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒的作用及其可能的作用機(jī)制。方法原代培養(yǎng)SD新生大鼠皮層神經(jīng)元，免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、NMDA組、內(nèi)皮型一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)組及HN組，分別采用MTT法、一氧化氮(NO)濃度測(cè)定、Hoechst染色及Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中細(xì)胞活性、NO濃度、細(xì)胞凋亡狀況及磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶( p-p38 MAPK)的表達(dá)。結(jié)果免疫熒光顯示90%細(xì)胞為NSE陽(yáng)性細(xì)胞，L-NAME組與HN組細(xì)胞活性均低于正常組而高于NMDA組，NO濃度、細(xì)胞凋亡數(shù)目及p-p38 MAPK的表達(dá)均高于正常組而低于NMDA組；L-NAME組與HN組相比，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡數(shù)目及p-p38 MAPK的表達(dá)升高。結(jié)論HN可部分通過抑制NO產(chǎn)生和p38 MAPK的激活而減少神經(jīng)元的凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

一氧化氮； Humanin；N-甲基-D-天冬氨酸； 興奮性神經(jīng)毒性； 細(xì)胞凋亡； 神經(jīng)元

Humanin(HN)是從阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者腦部分離出的一個(gè)由24個(gè)氨基酸組成的多肽[1-2]，被稱為AD特異性的神經(jīng)保護(hù)肽，然而研究發(fā)現(xiàn)，HN具有廣譜的神經(jīng)保護(hù)作用[3-4]，HN可通過內(nèi)源性途徑抑制Aβ31-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[5]。興奮性氨基酸(以谷氨酸為代表)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸在哺乳類動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)傳遞興奮信息的過程中起重要作用，當(dāng)其作用過度時(shí)，可通過N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspa-rate, NMDA)受體介導(dǎo)，引起興奮性神經(jīng)毒性[6]。興奮性神經(jīng)毒是造成神經(jīng)損傷的嚴(yán)重病理過程，在各種神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)、腦缺血損傷等疾病過程中均造成損傷[7-9]，研究表明，NMDA受體持續(xù)性激活，胞內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+活性增強(qiáng)，Ca2+與CaM結(jié)合，激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)而產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide,NO)，NO及其衍生物產(chǎn)生的毒性作用可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。故而NO的神經(jīng)毒作用即是NMDA受體激活所致興奮性神經(jīng)毒作用的延續(xù)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡中HN是否通過抑制NO的毒性而抑制神經(jīng)元的凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物與試劑

出生1 d內(nèi)的健康清潔級(jí)SD乳鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度18～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h照明。DMEM、胎牛血清(HyClone)、兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)多克?、窨?、羊抗兔IgG-FITC(博士德)，內(nèi)皮型NO合酶抑制劑(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)，細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(碧云天)，MTT(Sigma)，兔p-p38 MAPK抗體、羊抗兔 IgGⅡ抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

2方法

2.1皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 皮層神經(jīng)元的取材、分離、培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行并略加改進(jìn)。取新生24 h內(nèi)的SD大鼠，斷頭取腦，制成單細(xì)胞懸液，按(1～2)×108cells/L的密度接種在6孔板內(nèi)(預(yù)先放有多聚賴氨酸處理過的蓋玻片)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入阿糖胞苷(終濃度為10 μmol/L)以抑制非神經(jīng)元的過度增殖，作用24 h后半量換液，以后每隔1 d半量換液。

2.2皮層神經(jīng)元的免疫熒光染色 將培養(yǎng)在載玻片上的細(xì)胞用PBS沖洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，1%Triton X-100 (PBS稀釋)室溫10 min，5%BSA 37 ℃封閉15 min，加Ⅰ抗NSE抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，4℃取出后復(fù)溫10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加Ⅱ抗(FITC標(biāo)記)(1∶100)室溫避光孵育2 h，PBS沖洗3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO濃度檢測(cè) 原代培養(yǎng)神經(jīng)元接種于96孔板培養(yǎng)8 d，隨機(jī)分為4組：正常組、NMDA誘導(dǎo)組、L-NAME組和HN組。HN組加入100 μmol/L的HN作用16 h，L-NAME組加入終濃度為100 μmol/L的L-NAME作用1 h后，NMDA組、L-NAME組及HN組分別加入NMDA(其終濃度均為100 μmol/L)毒性誘導(dǎo)2 h，移取細(xì)胞培養(yǎng)液至另一96孔板，每孔50 μL，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。在各孔中加入室溫Griess Reagent I，每孔50 μL，各孔中加入室溫Griess Reagent II，每孔50 μL，酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)A值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品A值，計(jì)算各組中NO濃度。

2.4MTT法檢測(cè)神經(jīng)元活性 上述各組細(xì)胞毒性誘導(dǎo)2 h，細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，向96孔培養(yǎng)板的各孔中加入MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將各孔的培養(yǎng)液吸出150 μL，加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下自動(dòng)測(cè)A值。

2.5細(xì)胞凋亡-Hoechst染色 原代培養(yǎng)的神經(jīng)元接種于6孔板培養(yǎng)8 d，隨機(jī)分為4組:正常組、NMDA誘導(dǎo)組、L-NAME組和HN組。HN組加入100 μmol/L HN作用16 h,L-NAME組加入100 μmol/L L-NAME作用1 h，NMDA組、L-NAME組及HN組分別加入NMDA(其終濃度均為100 μmol/L)，毒性誘導(dǎo)2 h，細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出6孔板中的蓋玻片，PBS洗滌3遍，加入0.5 mL固定液，固定10 min，PBS洗滌3遍，每次3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min，PBS洗滌3遍，每次3 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞核。

2.6Western blotting檢測(cè)p-p38 MAPK蛋白 上述各組細(xì)胞毒性誘導(dǎo)2 h，細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后收集各組細(xì)胞，依次進(jìn)行蛋白提取、定量(加細(xì)胞裂解液裂解、BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度)，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加兔抗p-p38 MAPK(1∶200)4 ℃過夜，TBST洗10 min×3次，加生物素化Ⅱ抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗10 min×3次，按照ECL試劑盒說明進(jìn)行顯色、曝光。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1培養(yǎng)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，接種2 h后，大部分細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞圓且立體感較強(qiáng)；接種后24 h，大部分細(xì)胞長(zhǎng)出短的突起，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，胞體呈圓形或橢圓形，見圖1A；培養(yǎng)4 d細(xì)胞,突起伸長(zhǎng)、增粗，且分支多，突起交織成網(wǎng)狀；培養(yǎng)6～8 d細(xì)胞狀態(tài)最佳,細(xì)胞胞體飽滿，光暈明顯，形成完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，為實(shí)驗(yàn)的最好時(shí)間，見圖1B。

Figure 1. The neurons cultured for 24 h(A) or 6 d(B)(×200).

圖1培養(yǎng)24h和6d的神經(jīng)元形態(tài)

2神經(jīng)元的純度鑒定

NSE是神經(jīng)元的特異標(biāo)志物，存在神經(jīng)元的胞漿和突起中，熒光顯微鏡觀察為綠色，免疫熒光染色結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的細(xì)胞中，大部分細(xì)胞為綠染細(xì)胞(約90%)，形態(tài)良好，核大而清晰，見圖2。

3各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO濃度

與正常組(8.930±0.021)相比，NMDA組(13.325±0.035)、L-NAME組(11.987±0.016)和HN組(11.246±0.018)NO濃度明顯升高(P<0.01)；而與NMDA組相比，L-NAME組和HN組NO濃度明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；L-NAME組與HN組相比，NO濃度無(wú)明顯升高(P>0.05)，見圖3。

Figure 2. The NSE expression of neurons was displayed by immunofluorescence(×100).

圖2免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物NSE

Figure 3. The concentration of NO in cell culture supernatant of each group.**P<0.01vsnormal group;△△P<0.01vsNMDA group.

圖3各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO濃度

4各組神經(jīng)元活性檢測(cè)結(jié)果

與正常組(1.1190±0.0518)相比，NMDA組(0.7404±0.0802)和L-NAME組A值(0.8331±0.0461)顯著下降，細(xì)胞活性下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；HN組A值(0.9456±0.0328)下降，細(xì)胞活性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與NMDA組相比，L-NAME組和HN組A值增高(P<0.05，P<0.01)，細(xì)胞活性增強(qiáng)，L-NAME組與HN組相比，A值明顯降低，細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The results of neuron activity examination in each group.*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;△P<0.05,△△P<0.01vsNMDA group；▲P<0.05vsL-NAME group.

圖4各組神經(jīng)元活性檢測(cè)結(jié)果

5各組神經(jīng)元凋亡染色結(jié)果

神經(jīng)元發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮，因此Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。結(jié)果顯示，與正常組相比，NMDA組、L-NAME組和HN組神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著增多，細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異顯著(P<0.01)；而與NMDA組相比，L-NAME組和HN組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，細(xì)胞凋亡率降低，差異顯著(P<0.01)；L-NAME組和HN組相比，細(xì)胞凋亡數(shù)目增多(P<0.05)，見圖5、表1。

Figure 5. The results of Hoechst 33258 staining(×100). A:normal group; B: NMDA group; C:L-NAME group; D: HN group.

圖5各組細(xì)胞凋亡染色結(jié)果

表1 各組中神經(jīng)元的凋亡指數(shù)

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsNMDA group;▲P<0.05vsL-NAME group.

6Westernblotting檢測(cè)結(jié)果

對(duì)p-p38 MAPK進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，NMDA組、L-NAME組和HN組p-p38 MAPK表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；而與NMDA組相比，L-NAME組與HN組p-p38 MAPK表達(dá)明顯下降(P<0.01)；L-NAME組與HN組相比，p-p38 MAPK的表達(dá)明顯升高(P<0.01),見圖6。

討 論

2001年日本學(xué)者在AD患者腦部發(fā)現(xiàn)HN，HN具有廣譜的神經(jīng)保護(hù)作用[3-4]，HN可抑制中風(fēng)時(shí)大腦缺血再灌注損傷[12]，HN通過內(nèi)源性途徑抑制Aβ31-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[5]，HN可與細(xì)胞膜受體作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了在NMDA 誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中，HN是否可抑制NO的毒性而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)中成功培養(yǎng)了SD大鼠皮層神經(jīng)元，并加以鑒定，神經(jīng)元的純度較高，適合實(shí)驗(yàn)所需。NO濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，L-NAME組和HN組NO濃度明顯升高(P<0.01)；而與NMDA誘導(dǎo)組相比，L-NAME組和HN組NO濃度明顯降低(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，L-NAME組與HN組相比，NO濃度無(wú)明顯升高。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組相比，L-NAME組細(xì)胞活性下降(P<0.01)；

Figure 6. Expression of p-p38 MAPK in neurons analyzed by Western blotting.A:normal group;B:NMDA group;C:L-NAME group;D:HN group.**P<0.01vsnormal group;△△P<0.01vsNMDA group；▲▲P<0.01vsL-NAME group.

圖6各組神經(jīng)元中p-p38MAPK的表達(dá)

HN組細(xì)胞活性下降(P<0.05)；而與NMDA誘導(dǎo)組相比，L-NAME組和HN組細(xì)胞活性增強(qiáng)，L-NAME組與HN組相比，細(xì)胞活性明顯下降。細(xì)胞凋亡染色結(jié)果顯示,與正常組相比，L-NAME組和HN組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多，細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)；而與NMDA誘導(dǎo)組相比，L-NAME組和HN組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，L-NAME組和HN組相比，細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多。以上結(jié)果表明，一定程度上HN可抑制NO的毒性作用而增強(qiáng)細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡數(shù)目。

p38 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物信號(hào)引起核反應(yīng)的重要通路，激活的p38 MAPK 通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控特定基因表達(dá)，導(dǎo)致蛋白合成、細(xì)胞表面受體表達(dá)、細(xì)胞骨架重構(gòu)， 最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[14]。在缺血性腦損傷模型中，NO誘導(dǎo)p38 MAPK路徑的激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的缺失[15]，NOS與p38 MAPK的相互作用可誘導(dǎo)缺血神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[16]。過度激活p38 MAPK路徑而引起細(xì)胞凋亡，可能是NO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要路徑之一。

本實(shí)驗(yàn)中，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比， L-NAME組與HN組中p-p38 MAPK的表達(dá)均顯著升高；而與NMDA組相比，二者p-p38 MAPK的表達(dá)明顯下降；L-NAME組與HN組相比，p-p38 MAPK的表達(dá)明顯升高。p38 MAPK途徑介導(dǎo)了NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡，抑制與此相關(guān)的凋亡信號(hào)通路可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。HN可能通過抑制NO產(chǎn)生及p38 MAPK路徑的激活，減少神經(jīng)元凋亡。但HN對(duì)NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的抑制作用不僅僅局限于對(duì)NO毒性的抑制，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Hashimoto Y, Niikura T, Tajima H, et al. A rescue factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheimer's disease genes and Aβ [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(11): 6336-6341.

[2] Hashimoto Y, Ito Y, Niikura T, et al. Mechanisms of neuroprotection by a novel rescue factor humanin from Swedish mutant amyloid precursor protein[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 283(2):460-468.

[3] Jung SS, Van Nostrand WE. Humanin rescues human cerebrovascular mooth muscle cells from abeta-induced toxicity[J]. J Neurochem, 2003, 84(2): 266-272.

[4] Kariya S, Takahashi N, Ooba N, et al. Humanin inhibits cell death of serum-deprived PC12h cells[J]. Neuroreport, 2002, 13(6):903-907.

[5] Li LM, Zhang Y, Qiao JT, et al. Humanin protects neurons against apoptosis induced by Aβ31-35through suppression of intrinsic pathway [J]. Acta Physiologica Sinica, 2010, 62(2): 93-100.

[6] Gray CW, Patel AJ. Neurodegeneration mediated by glutamate and β-amyloid peptite：a comparison and possible interaction[J]. Brain Res, 1995, 691(1-2): 169-179.

[8] Lipton SA, Rosenberg PA. Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders[J]. N Engl J Med, 1994, 330(9):613-622.

[9] Palmer GC. Neuroprotection by NMDA receptor antagonists in a variety of neuropathologies[J]. Curr Drug Targets, 2001, 2(3):241-271.

[10]Silva RF, Falc?o AS, Fernandes A, et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity[J]. Toxicol Lett, 2006, 163(1):1-9.

[11]梅 莉, 路 浩, 劉宗平, 等. 新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法的建立及其活性鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2007, 37(3): 264-268.

[12]Xu X, Chua C, Gao J. Humanin is a novel neuroprotective agent against stroke[J].Stroke, 2006, 37(10):2613-2619.

[13]Hashimoto Y,Kurita M,Aiso S, et al. Humanin inhibits neuronal cell death by interacting with a cytokine receptor complex or complexes involving CNTF receptor α/WSX-1/gp130[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20(12):2864-2873.

[14]Brown GC. Nitric oxide and neuronal death[J].Nitric Oxide,2010,23(3):153-165.

[15]Chen H, Sun Y, Li SJ, et al.Nitric oxide as an upstream signal of p38 mediates hypoxia/reoxygenation-induced neuronal death[J]. Neurosignals ,2009,17(2):162-168.

[16]陳春美, 楊衛(wèi)忠, 王春華，等. NOS、p38 MAPK、 caspase-3介導(dǎo)大鼠腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能通路的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志, 2008, 35(2): 107-111.

Humaninprotectsneuronsbyinhibitingnitricoxide

SONG Hai-yan, DENG Xiao-hui, MIAO Ying-ying

(DepartmentofHumanAnatomy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:shy80825@yahoo.com.cn)

AIM: To study the effect and mechanism of humanin (HN) on inhibition of excitatory neurotoxicity induced byN-methyl-D-asparate(NMDA).METHODSCortical neurons from newborn SD rat were primarily cultured. The purity of the cells was assessed by immunofluorescence technique. The neurons were randomly divided into normal group, NMDA group,NG-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) group and HN group. The activity of the neurons was detected by MTT assay. Nitric oxide (NO) concentration was detected by NO detection kit, and the neuronal apoptosis was examined by Hoechst staining. The expression of p-p38 MAPK in the neurons was determined by Western blotting.RESULTSImmunofluorescence test showed that 90% cells were neuron-specific enolase(NSE)-positive staining cells. The activity of the neurons in L-NAME group and HN group was lower than that in normal group, but higher than that in NMDA group. NO concentration, the numbers of apoptotic cells, and the expression of p-p38 MAPK in L-NAME group and HN group were higher than those in normal group, but lower than those in NMDA group. Compared with HN group, the activity of the neurons decreased, the numbers of apoptotic cells and the expression of p-p38 MAPK increased in L-NAME group.CONCLUSIONHN inhibits the apoptosis of neurons partly by inhibiting the NO toxicity, thus protecting the neurons.

Nitric oxide; Humanin;N-methyl-D-asparate; Excitatory neurotoxicity; Apoptosis; Neurons

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.030