湯紹輝， 張良鵬， 吳小娟， 張嫚嫚， 王曠靖， 周鴻科， 羅羽宏， 曹明溶△

(暨南大學附屬第一醫(yī)院 1消化科,2普通外科，廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)09-1633-06

2012-03-22

2012-05-11

廣東省自然科學基金資助項目(No.9151008901000001)；廣東省醫(yī)學科學技術研究基金資助項目(No.A2009367)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助(No.11610407)

△通訊作者 Tel：020-38688039； E-mail：xiger66666@163.com

乙型肝炎病毒X蛋白通過降低P4啟動子甲基化水平上調人IGF-II基因的轉錄*

湯紹輝1， 張良鵬1， 吳小娟1， 張嫚嫚1， 王曠靖1， 周鴻科1， 羅羽宏2， 曹明溶2△

(暨南大學附屬第一醫(yī)院1消化科,2普通外科，廣東 廣州 510632)

目的構建穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌細胞株HepG2-HBx，探討HBx對胰島素樣生長因子 II(IGF-II)基因P4啟動子甲基化水平及轉錄表達的影響。方法應用基因重組技術，構建含HBx基因的重組逆轉錄病毒載體pBABE-puro-HBx，采用磷酸鈣共沉淀法將其轉染293FT包裝細胞產生逆轉錄病毒，感染HepG2肝癌細胞，采用嘌呤霉素進行陽性克隆篩選，Western blotting鑒定表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx。采用亞硫酸氫鹽測序法及實時熒光定量RT-PCR檢測HepG2-HBx細胞中P4啟動子甲基化水平及P4 mRNA表達水平變化。進一步將體外甲基化的人IGF-II基因P4啟動子驅動的熒光素酶報告載體pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X質粒共轉染HepG2肝癌細胞，采用亞硫酸氫鹽測序法及雙螢光素酶實驗檢測pGL3-P4載體上P4啟動子甲基化水平及轉錄調控活性變化。結果(1)經Western blotting鑒定，成功構建了穩(wěn)定表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx；(2)表達HBx蛋白的HepG2-HBx細胞中P4啟動子甲基化CpG位點的比例(9.0%)明顯低于對照細胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01)，而其P4 mRNA表達水平則為對照細胞HepG2-control的2.8倍；(3)共轉染pCMV-tag2B-X質粒的HepG2細胞中pGL3-P4載體上P4啟動子甲基化CpG位點的比例(60.8%)明顯低于共轉染對照質粒pCMV-tag2B的HepG2細胞(84.1%)(P<0.01)，而前者P4啟動子相對螢光素酶活性(14.12±0.89)則明顯高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。結論HBx蛋白可降低IGF-II基因P4啟動子甲基化水平，進而上調其轉錄表達。

乙型肝炎病毒X蛋白; 胰島素樣生長因子II； 啟動子； DNA甲基化

人胰島素樣生長因子II(insulin-like growth factor II，IGF-II)是一種由67個氨基酸殘基組成的多肽，其基因含9個外顯子和4個啟動子(P1～P4)。近年我們與其他學者研究發(fā)現，由于P3和P4啟動子再激活而導致的IGF-II基因過表達與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[1-2]。P4啟動子再激活的機制可能涉及幾個方面，其中，我們前期的研究顯示肝癌組織中P4啟動子低甲基化可能是其再激活而致IGF-II大量表達的機制之一[3]。但是，引起P4啟動子低甲基化的原因及機制尚不明確。

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在肝細胞癌的發(fā)生中具有重要作用[4]，但其致癌機制尚未完全明確。在我國，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝細胞癌的主要病因，而我們前期的研究顯示絕大多數肝癌組織IGF-II基因P4啟動子甲基化水平明顯降低[3]，此現象是否提示HBx蛋白表達與P4啟動子低甲基化存在相關性？目前國內外尚未見相關的研究報道。鑒于此，本研究擬探討HBx蛋白對IGF-II基因P4啟動子甲基化水平及轉錄表達的影響，為闡明肝癌發(fā)生中P4啟動子低甲基化的原因及機制奠定基礎。

材 料 和 方 法

1材料

PrimeSTAR HS DNA聚合酶為TaKaRa產品，抗HBx抗體為Abcam產品，Trizol 試劑為Invitrogen產品，雙螢光素酶報告實驗系統(tǒng)為Promega產品，pBABE-puro逆轉錄病毒載體為Addgene產品，pCMV-tag2B-X質粒(含HBx基因)及對照質粒pCMV-tag2B由廣州南方醫(yī)科大學肝病中心梁敏鋒博士惠贈，人IGF-II基因P4啟動子驅動的螢光素酶報告載體pGL3-P4(含P4啟動子-1 129～+117片段)為本研究團隊構建，HepG2肝癌細胞株購買于ATCC，293FT細胞購自Invitrogen。

2方法

2.1穩(wěn)定表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx構建

2.1.1含HBx基因的重組逆轉錄病毒載體pBABE-puro-HBx構建 根據pCMV-tag2B-X質粒上HBx基因序列設計引物擴增HBx基因，上游引物5’-CCG CTC GAG ATG GCT GCT AGG CTG TGC TG-3’(含XhoI位點)，下游引物5’-CG GAA TTC TTA GGC AGA GGT GAA AAA GTT G-3’(含EcoR I位點)，擴增片段長度465 bp。將HBx基因的PCR產物純化，純化后的產物及pBABE-puro載體分別經XhoI和EcoR I雙酶切，T4 DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α，用菌落PCR及雙酶切鑒定后送上海英駿生物公司測序分析。

2.1.2磷酸鈣共沉淀法轉染293FT包裝細胞產生逆轉錄病毒 將293FT包裝細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜。將20 μg PIK包裝質粒分別與20 μg pBABE-puro-HBx載體及對照載體pBABE-puro混合，再依次加入適量CaCl2、H2O及HBS溶液，混勻，加入待轉染的293FT細胞中，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育5 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。收集含病毒的上清液，過濾，分裝置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3病毒上清液感染HepG2肝癌細胞及陽性克隆篩選 將含聚凝胺(4 mg/L)的病毒上清液加入對數生長期的HepG2肝癌細胞中，37 ℃培養(yǎng)3 h，吸棄培養(yǎng)基，換新病毒上清液，如此重復感染3次，完畢后換正常培養(yǎng)基。感染結束后48 h加入嘌呤霉素(0.5 mg/L)篩選陽性克隆(包括含pBABE-puro-HBx載體及對照載體pBABE-puro的HepG2細胞克隆)。

2.1.4Western blotting鑒定表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx 制備HepG2-HBx肝癌細胞及對照肝癌細胞HepG2-control(含對照載體pBABE-puro)總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用脫脂奶粉封閉。加入稀釋的Ⅰ抗(抗HBx及抗β-actin)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠Ⅱ抗，增強化學發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)攝像及分析結果。

2.2表達HBx蛋白的肝癌細胞HepG2-HBx及對照肝癌細胞HepG2-control中P4啟動子甲基化狀態(tài)及P4 mRNA表達水平分析

2.2.1亞硫酸氫鹽測序 制備HepG2-HBx細胞及對照細胞HepG2-control基因組DNA，取2 μg DNA，按CpGenomeTMDNA Modification 試劑盒(BioLabs產品)說明進行DNA修飾，純化回收修飾后的DNA用于PCR擴增。擴增引物根據P4啟動子序列(GenBank進入號NT_009308)設計，上游引物5’-GTA GAA GTT TAT TTT GGT ATG TTG A-3’，下游引物5’-AAT CTC CTT CCC ACC TCC TTA TAT A-3’，片段長度307 bp，擴增區(qū)-555～-248。PCR產物亞克隆入pMD19-T載體，挑選陽性克隆進行測序分析，共測序8個克隆。

2.2.2實時熒光定量RT-PCR 根據文獻[5]設計IGF-II基因P4啟動子特異的轉錄子(以下簡稱P4轉錄子)，上游引物5’-TCT CCT GTG AAA GAG ACT TCC AG-3’，下游引物5’- CAA GAA GGT GAG AAG CAC CAG -3’，片段長度137 bp。以β-actin為對照。采用Trizol試劑制備HepG2-HBx細胞及對照細胞HepG2-control總RNA，用MMLV逆轉錄酶合成cDNA，實時熒光定量PCR擴增與檢測IGF-II基因P4 mRNA表達水平。實驗過程中，每個樣本同時擴增3復管，并連續(xù)進行2次實驗。采用相對定量法(2-ΔΔCt)表示目的基因表達量。

2.3雙螢光素酶報告實驗系統(tǒng)及亞硫酸氫鹽測序檢測HBx蛋白對P4啟動子轉錄調控的影響

2.3.1pGL3-P4載體體外甲基化、細胞轉染及瞬時表達 將pGL3-P4載體在體外用SssI CpG甲基轉移酶(BioLabs產品) 孵育，然后將純化后的反應產物用HpaⅡ內切酶消化，以證實完全甲基化。將完全甲基化pGL3-P4載體與pCMV-tag2B-X或其對照空質粒pCMV-tag2B用脂質體法共轉染HepG2肝癌細胞。操作完畢，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h。實驗過程中，每個共轉染實驗同時做3復孔，并連續(xù)進行2次實驗。

2.3.2雙螢光素酶實驗 轉染48 h后，制備上述細胞裂解物，按雙螢光素酶報告實驗系統(tǒng)說明檢測細胞裂解物的熒光素酶活性。

2.3.3亞硫酸氫鹽測序 轉染48 h后，制備上述細胞基因組DNA，取2μg DNA，按CpGenomeTMDNA Modification 試劑盒說明進行DNA修飾，純化回收修飾后的DNA用于巢式PCR擴增。擴增引物根據pGL3-Basic載體(GenBank進入號U47295.2)及P4啟動子序列設計，上、下游外側引物分別為5’-AAT AGG TTG TTT TTA GTG TAA GTG-3’及5’-TCC TCC CCC CCA AAC TCA AC-3’；上、下游內側引物分別為5’-AGT GTA AGT G TA GGT GTT AG-3’及5’-CAC ACC ACT TAC CTA AAA AC-3’，片段長度241 bp，擴增區(qū)為pGL3-P4載體上P4啟動子-1 129～-926片段。PCR產物亞克隆入pMD19-T載體，挑選陽性克隆進行測序分析，共測序8個克隆。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1重組逆轉錄病毒載體pBABE-puro-HBx的構建鑒定

以pCMV-tag2B-X載體為模板，擴增出HBx基因，克隆入pBABE-puro載體，轉化大腸桿菌DH5α后抽提重組質粒，經XhoI和EcoR I雙酶切得到1條約465 bp的HBx目的片段及載體大片段，見圖1A、B。目的片段測序分析結果與GenBank中AF223955.1HBx基因相符。

Figure 1. Construction and identification of HepG2-HBx cell lines expressing hepatitis B virus X protein (HBx). A: electrophoresis analysis of PCR product forHBxgene;B:electrophoresis analysis of dual enzyme digestion of pBABE-puro-HBx recombinant retroviral vector;C: Western blot analysis of HBx protein expression in HepG2-HBx cell line.M:DL2000 DNA marker.

圖1表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx的構建與鑒定

2表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx的鑒定

應用Western blotting檢測HepG2-HBx及對照細胞HepG2-control的HBx蛋白表達情況，結果顯示，前者有明顯的HBx表達，后者則為陰性，表明表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx構建成功，見圖1C。

3HBx蛋白對HepG2-HBx肝癌細胞P4啟動子甲基化水平及P4mRNA表達水平的影響

根據人IGF-II基因P4啟動子序列設計引物擴增了P4啟動子的-555～-248片段，該片段共含有18個CpG位點。亞硫酸氫鹽測序結果顯示，HepG2-HBx細胞中甲基化CpG位點的比例(9.0%)明顯低于其對照細胞HepG2-control(25.0%)，P<0.01,見圖2。熒光定量RT-PCR結果顯示，HepG2-HBx細胞P4 mRNA表達水平約為其對照細胞HepG2-control的2.8倍,見圖2。

Figure 2. Analysis of the P4 promoter methylation status (A;2=13.009，P<0.01) and P4 mRNA expression (B) ofICF-IIgene in HepG2-HBx cell line and HepG2-control cell line.Each row of circles represented sequencing results of a clone; TSS: transcription start site±s.n=6.**P<0.01vsHepG2-control..

圖2HepG2-HBx及對照細胞HepG2-control中P4啟動子甲基化水平及P4mRNA表達水平分析

4HBx蛋白對體外甲基化pGL3-P4質粒上P4啟動子甲基化水平及轉錄活性的影響

根據pGL3-P4重組質粒上pGL3-Basic載體及P4啟動子序列設計2對引物(2條上游引物序列位于pGL3-Basic載體上)，采用巢式PCR技術擴增pGL3-P4質粒上P4啟動子的-1 129～-924片段，該片段共含有22個CpG位點。亞硫酸氫鹽測序結果顯示，共轉染pCMV-tag2B-X質粒的HepG2細胞中P4啟動子-1 129～-924片段甲基化CpG位點的比例(60.8%)明顯低于共轉染對照質粒pCMV-tag2B的HepG2細胞(84.1%)，P<0.01，見圖3。另一方面，雙螢光素酶實驗結果顯示，前者P4啟動子相對熒光素酶活性(14.12±0.89)明顯高于后者(4.61±0.76)，P<0.01，見圖3。

討 論

HBx是一種多功能調節(jié)蛋白，在HBV感染相關肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，但其致癌機制復雜，許多環(huán)節(jié)尚未明確。目前的資料顯示，其作用機制可能涉及以下幾個方面。(1)HBx可反式激活各種病毒和細胞啟動子[6]。(2)HBx參與細胞凋亡過程。在肝細胞感染HBV早期，HBx抑制凋亡，使基因突變得以積累；在晚期，HBx誘導肝細胞凋亡，促進HBV復制及感染擴散，逃避宿主細胞免疫功能，使癌前肝細胞得以存活，并進一步惡性轉化[7-9]。(3)通過表觀遺傳機制導致腫瘤抑制基因等DNA序列的甲基化狀態(tài)異常等[10-11]。

人IGF-II是一種重要的胎兒生長因子及有絲分裂原，在胚胎生長發(fā)育、細胞增殖與分化等方面均有重要作用。IGF-II的表達具有組織和發(fā)育階段特異性。在胎兒的肝臟、腎臟、小腸、肺臟、大腦皮層等組織具有高濃度的IGF-II mRNA表達，出生后急劇減少，但成人肝臟仍有一定水平的IGF-II mRNA表達[12-13]。IGF-II基因的這種表達特征與其復雜的基因結構，即含有9個外顯子和4個啟動子有關。在個體不同組織及不同生長發(fā)育階段，4個啟動子呈現出動態(tài)活性，總共編碼5種5′端非翻譯區(qū)不同的IGF-II mRNA，但其成熟蛋白產物相同。例如，在胎肝和新生兒肝中，啟動子P2-P4被激活，P1失活，其中P3活性最大而致IGF-II mRNA大量表達；在出生2個月后，肝臟IGF-II mRNA表達量則顯著下調，約為新生兒峰值的1/10，一直至成人期都維持于此低水平狀態(tài)，其表達主要受控于P1啟動子，P2和P4啟動子活性弱，而P3啟動子在大多數成人肝臟呈關閉狀態(tài)[13]。

Figure 3. Analysis of methylation levels (A:2=23.922,P<0.01) and the relative luciferase activity (B) of P4 promoter 48 h after co-transfection ofinvitromethylated pGL3-P4 vector and pCMV-tag2B-X or control empty plasmid pCMV-tag2B into HepG2 cells.Each row of circles represented sequencing results of a clone; TSS: transcription start site±s.n=6.**P<0.01vsHepG2 (2).

圖3體外甲基化pGL3-P4載體與pCMV-tag2B-X或對照空質粒pCMV-tag2B共轉染HepG2肝癌細胞48h后P4啟動子甲基化水平及相對熒光素酶活性分析

研究發(fā)現，DNA甲基化狀態(tài)異常與人類腫瘤的發(fā)生密切相關。在許多腫瘤中基因組DNA存在廣泛低甲基化和局部區(qū)域高甲基化共存現象。一般說來，真核基因啟動子高甲基化可抑制該基因表達，而低甲基化則促進其表達[14]。 近年發(fā)現，IGF-II在動物模型和人類肝臟的癌前病變及肝癌組織中呈過量表達，且IGF-II過表達與P3、P4啟動子的再激活密切相關[1, 2, 15]。P4啟動子再激活的機制可能有多個方面。我們前期發(fā)現：與正常成人肝組織相比，肝癌組織中P4啟動子甲基化水平明顯降低，且DNA低甲基化是P4啟動子再激活的機制之一[3]。但是，引起P4啟動子低甲基化的原因及發(fā)生機制尚不明確。Su等[16]檢測了419例肝癌組織，結果顯示絕大多數標本同時存在IGF-II和HBx蛋白表達；我們前期的研究顯示：在HBV相關的肝癌患者中，絕大多數肝癌組織存在P4啟動子低甲基化及P4 mRNA高表達[2-3]。這些結果提示，HBx蛋白表達或HBV感染可能促進肝癌組織IGF-II基因過表達。但二者之間確切的關系及其作用機制尚未明確。

在本研究中，我們構建了表達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx，結果顯示，HepG2-HBx細胞P4啟動子-555～-248片段甲基化CpG位點的比例明顯低于其對照細胞HepG2-control，而其P4 mRNA表達水平則為其對照細胞HepG2-control的2.8倍，提示HBx蛋白可降低P4啟動子甲基化水平，進而促進IGF-II基因轉錄表達。為了進一步驗證上述研究結果，我們構建了P4啟動子驅動的螢光素酶報告載體pGL3-P4，將其體外甲基化后與含HBx基因的pCMV-tag2B-X質粒共轉染HepG2肝癌細胞，結果顯示，共轉染pCMV-tag2B-X質粒的HepG2細胞中pGL3-P4載體上P4啟動子-1 129～-924片段甲基化CpG位點的比例明顯低于共轉染其對照空質粒pCMV-tag2B的HepG2細胞，而其P4啟動子相對螢光素酶活性則明顯高于后者。上述兩部分實驗結果表明，HBx蛋白可誘導肝癌細胞IGF-II基因P4啟動子甲基化水平降低，進而上調P4啟動子轉錄活性，從而促進IGF-II基因表達。本結果與Zheng等[10]報道相似，他們發(fā)現HBx蛋白可部分或完全阻止DNA 甲基轉移酶3A(DNA methyltransferases 3A，DNMT3A)與CDH6基因的啟動子結合，引起其低甲基化從而激活轉錄。Park等[17]也發(fā)現，HBx蛋白可下調DNMT3B表達，進而誘導肝癌細胞基因組DNA衛(wèi)星2重復序列低甲基化。

本研究結果將與肝癌發(fā)生有關的兩個重要因素——HBx蛋白與IGF-II基因過表達聯系起來，一方面為全面深入認識HBx蛋白致肝細胞癌分子機制補充了新資料，另一方面為進一步闡明肝癌發(fā)生中P4啟動子低甲基化的原因及機制奠定了基礎。

[1] Breuhahn K, Schirmacher P. Reactivation of theinsulin-likegrowthfactor-IIsignaling pathway in human hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(11):1690 -1698.

[2] Tang SH, Yang DH, Huang W, et al. Differential promoter usage for insulin-like growth factor-II gene in Chinese hepatocellular carcinoma with hepatitis B virus infection[J]. Cancer Detect Prev, 2006, 30(2):192-203.

[3] Tang SH, Yang DH, Huang W, et al. Hypomethylated P4 promoter induces expression of the insulin-like growth factor-II gene in hepatocellular carcinoma in a Chinese population[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(14): 4171-4177.

[4] Shon JK, Shon BH, Park IY, et al. Hepatitis B virus-X protein recruits histone deacetylase 1 to repress insulin-like growth factor binding protein 3 transcription[J]. Virus Res, 2009, 139(1):14-21.

[5] Liao B, Hu Y, Herrick DJ, et al. The RNA-binding protein IMP-3 is a translational activator of insulin-like growth factor II leader-3 mRNA during proliferation of human K562 leukemia cells[J]. J Biol Chem, 2005, 280(18):18517-18524.

[6] Ng SA, Lee C. Hepatitis B virus X gene and hepatocarcinogenesis[J]. J Gastroenterol, 2011, 46(8):974-990.

[7] Kew MC. Hepatitis B virus x protein in the pathogenesis of hepatitis B virus-induced hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2011, 26(Suppl 1):144-152.

[8] Lau JY, Xie X, Lai MM, et al. Apoptosis and viral hepatitis[J]. Semin Liver Dis, 1998, 18(7): 169-176.

[9] Assrir N, Soussan P, Kremsdorf D, et al. Role of the hepatitis B virus proteins in pro- and anti-apoptotic processes[J]. Front Biosci, 2010, 15:12-24.

[10]Zheng DL, Zhang L, Cheng N, et al. Epigenetic modification induced by hepatitis B virus X protein via interaction withdenovoDNA methyltransferase DNMT3A[J]. J Hepatol, 2009, 50(2):377-387.

[11]Zhu YZ, Zhu R, Fan J, et al. Hepatitis B virus x protein induces hypermethylation of p16INK4Apromoter via DNA methyl transferases in the early stage of HBV-associated hepatocarcinogenesis[J]. J Viral Hepat, 2010, 17(2): 98-107.

[12]Birnbacher R, Amann G, Breitschopf H,et al. Cellular localization of insulin-like growth factor II mRNA in the human fetus and the placenta: detection with a digoxigenin-labeled cRNA probe and immunocytochemistry[J]. Pediatr Res, 1998, 43(5):614-620.

[13]Li X, Cui H, Sandstedt B, et al. Expression levels of the insulin-like growth factor-II gene (IGF2) in the human liver: developmental relationships of the four promoters[J]. J Endocrinol, 1996, 149(1):117-124.

[14]Costello JF, Fruhwald MC. Aberrant CpG-island methylation has nonrandom and tumor-type-specific patterns[J]. Nat Genet, 2000, 24(7):132-138.

[15]Nussbaum T, Samarin J, Ehemann V, et al. Autocrine insulin-like growth factor-II stimulation of tumor cell migration is a progression step in human hepatocarcinogenesis[J]. Hepatology, 2008, 48(1):146-156.

[16]Su Q, Liu YF, Zhang JF, et al. Expression of insulin-like growth factor-II in hepatitis B cirrhosis and hepatocellular carcinoma: its relationship with hepatitis B virus antigen expression[J]. Hepatology, 1994, 19(4 pt 1): 788-799.

[17]Park IY, Sohn BH, Yu E, et al. Aberrant epigenetic modifications in hepatocarcinogenesis induced by hepatitis B virus X protein[J]. Gastroenterology, 2007, 132(4):1476-1494.

HBxreducesmethylationlevelofP4promoterandup-regulateshumanIGF-IIgenetranscription

TANG Shao-hui1, ZHANG Liang-peng1, WU Xiao-juan1, ZHANG Man-man1, WANG Kuang-jing1, ZHOU Hong-ke1, LUO Yu-hong2, CAO Ming-rong2

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xiger66666@163.com)

AIM: To establish HepG2-HBx cell line stably expressing hepatitis B virus X protein (HBx) and to investigate the effect of HBx on the methylation status and transcription activity of human insulin-like growth factor II (IGF-II) gene P4 promoter.METHODSHBxgene was cloned into the pBABE-puro retrovirus vector to construct recombinant plasmid pBABE-puro-HBx. The latter was transfected into 293FT package cells to generate retrovirus-pBABE-puro-HBx. HepG2 cells were infected with the virus suspension and the resistant cell clones were selected by puromycin. HBx expression in the HepG2-HBx cells was analyzed by Western blotting. P4 promoter methylation status and P4 mRNA expression in HepG2-HBx cells and HepG2-control cells were detected by bisulfite sequencing and real-time fluorescence quantitative RT-PCR, respectively. Furthermore,invitromethylated pGL3-P4 vector driven by P4 promoter of human IGF-II gene was co-transfected into HepG2 cells with pCMV-tag2B-X plasmid carryingHBxgene or control empty plasmid pCMV-tag2B, and the methylation status and transcription activity of P4 promoter in pGL3-P4 vector were analyzed by bisulfite sequencing and dual-luciferase reporter assay system, respectively.RESULTSHepG2-HBx cell line stably expressing HBx was successfully constructed. The percentage of methylated CpG dinucleotides in P4 promoter was lower in HepG2-HBx cells (9.0%) than that in HepG2-control cells (25.0%) (P<0.01), and P4 mRNA expression level of the former was 2.8 times higher than that of the latter. The percentage of methylated CpG dinucleotides in P4 promoter at pGL3-P4 vector was lower in the HepG2 cells co-transfected with pCMV-tag2B-X (60.8%) than that in the HepG2 cells co-transfected with control empty plasmid pCMV-tag2B (84.1%) (P<0.01), and the relative luciferase activity of the former (14.12±0.89) was higher than that of the latter (4.61±0.76) (P<0.01).CONCLUSIONHBx may reduce the methylation level of P4 promoter and up-regulates humanIGF-IIgene transcription.

Hepatitis B virus X protein; Insulin-like growth factor II; Promoters; DNA methylation

R735

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.017