柴大軍, 寧若冰, 祝 江, 許昌聲, 謝 泓, 林金秀

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

1000-4718(2012)09-1537-06

2012-04-17

2012-07-18

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目 (No.30900586)

△通訊作者 Tel： 0591-87982516； E-mail: caidajun@medmail.com.cn

·論著·

阿托伐他汀通過(guò)抑制PKC的激活對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)*

柴大軍△, 寧若冰, 祝 江, 許昌聲, 謝 泓, 林金秀

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

目的探討阿托伐他汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的影響及其作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)HUVECs，以25 mmol/L葡萄糖干預(yù)，模擬糖尿病患者體內(nèi)環(huán)境，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平，采用Lucigenin分析方法測(cè)定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡雜交的方法檢測(cè) NADPH氧化酶亞基Nox4和Nox2/gp91phox的表達(dá)水平，用免疫印跡雜交方法檢測(cè)蛋白激酶C (PKC)蛋白的磷酸化水平。結(jié)果(1)在高糖環(huán)境(終濃度為25 mmol/L)下，HUVECs內(nèi)ROS生成顯著增加，NADPH氧化酶的活性顯著增強(qiáng)，NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)；(2)阿托伐他汀可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的ROS 生成、NADPH氧化酶活性的增強(qiáng)及NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基表達(dá)水平的增加幅度，且具有濃度依賴性；(3) PKC抑制劑(PKC inhibitor peptide, 20 μmol/L)可顯著抑制高糖環(huán)境下ROS的生成、NADPH氧化酶活性的增強(qiáng)及NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基表達(dá)水平的增加幅度；(4) 阿托伐他汀可抑制高糖誘導(dǎo)的PKC蛋白的磷酸化。結(jié)論P(yáng)KC的活化參與了高糖誘導(dǎo)的HUVECs產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)。阿托伐他汀通過(guò)抑制PKC蛋白的活化對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

高糖; 氧化應(yīng)激; 他汀類; 蛋白激酶C

糖尿病已成為全球性的健康問(wèn)題，而糖尿病患者體內(nèi)血糖升高能通過(guò)多種信號(hào)途徑激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶的活化增加，進(jìn)而引起活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成增加，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，加速了動(dòng)脈粥樣硬化的形成[1]。NADPH氧化酶是血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的主要來(lái)源，由NADPH氧化酶4 (NADPH oxidase 4, Nox4)、NADPH氧化酶2( NADPH oxidase 2, Nox2/gp91phox)和p22phox蛋白等多個(gè)亞基組成[2]。有許多研究表明ROS產(chǎn)生過(guò)多與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)不僅是二酰甘油(diacylglycerol, DAG) 和佛波酯腫瘤啟動(dòng)子的下游靶點(diǎn)，也參與了對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶的調(diào)控[3]。高血糖能引起血管組織中DAG-PKC通路的激活，抑制PKC的活化可以顯著改善糖尿病和高糖對(duì)血管內(nèi)皮功能的損傷[3-4]。 他汀類藥物作為目前降脂治療的關(guān)鍵用藥，其在降脂作用之外所具有的抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用可能與其抗氧化能力有關(guān)[5-6]。本研究將討論阿托伐他汀在高糖誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中的作用及相關(guān)機(jī)制，為阿托伐他汀心血管保護(hù)作用的發(fā)揮尋求新的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

M199培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液、Trizol和Opti-MEM購(gòu)自Invitrogen；real-time PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa； 2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酯(2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2-DCFDA)、二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)和I型膠原酶購(gòu)自Sigma；PKC抑制劑(PKC inhibitor peptide)購(gòu)自Millipore；鼠抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗人PKC單克隆抗體、羊抗人p-PKC多克隆抗體和羊抗人Nox4多克隆抗體購(gòu)自 Santa Cruz；兔抗人Nox2/gp91phox多克隆抗體購(gòu)自Abcam。

2方法

2.1人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[7]的方法,從健康臍帶的臍靜脈應(yīng)用0.1% I型膠原酶消化和分離內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞離心收集后接種于預(yù)先用0.1%明膠包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)并用M199培養(yǎng)基+20% FBS+25mg/L內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子+90 mg/L肝素在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。依據(jù)細(xì)胞典型的鋪路石樣生長(zhǎng)形態(tài)，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞Ⅷ因子抗原等方法鑒定HUVECs，細(xì)胞的純度在95%以上。為避免多次傳代過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生與存活時(shí)間相關(guān)的變化，本研究中僅選用1～3代細(xì)胞用于研究。

2.2HUVECs的干預(yù)和分組 25 mmol/L高濃度葡萄糖常被用來(lái)刺激內(nèi)皮細(xì)胞，體外模擬糖尿病患者的體內(nèi)高糖環(huán)境[8]。等摩爾甘露醇作為對(duì)照以排除高糖干預(yù)時(shí)因細(xì)胞外滲透壓急性改變產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。將細(xì)胞分為正常組(葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L)、25 mmol/L甘露醇組和高糖組(葡萄糖終濃度為25 mmol/L)、高糖+阿托伐他汀(0.01 μmol/L)組、高糖+阿托伐他汀(0.1 μmol/L)組、高糖+阿托伐他汀(1 μmol/L)組和高糖+PKC抑制劑組。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧離子的水平 H2-DCFDA是一種脂溶性熒光底物，能順利通過(guò)細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化后變成2’，7’-dichlorodihydrofluorescein，后者產(chǎn)生可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)到綠色熒光。細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，于培養(yǎng)液內(nèi)加入10 μmol/L H2-DCFDA, 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60 min，吸去培養(yǎng)液，用預(yù)溫的PBS洗細(xì)胞1次，用0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。采用525 nm波長(zhǎng)濾光片進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)各標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞比例和熒光強(qiáng)度。

2.5NADPH氧化酶活性測(cè)定 NADPH氧化酶活性測(cè)定采用Lucigenin分析方法，具體方法參照我們已發(fā)表文獻(xiàn)[9]。

2.6逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR HUVECs被干預(yù)結(jié)束后，采用real-time PCR試劑盒依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR。Nox4引物序列：正義鏈 5′- AGG GCC AGA GTA TCA CTA CCT CCA C-3′，反義鏈5′- TGA TCC TCG GAG GTA AGC CAA G -3′； Nox2/gp91phox引物序列： 正義鏈5’-AAA TGG ATC GCA TCT GTG AC-3’，反義鏈5’-TGG CCA CAC TAA CAG TGA TTT AGA G-3’； 內(nèi)參照GADPH引物序列： 正義鏈5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，反義鏈5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。所有引物序列由TaKaRa公司合成。

2.7細(xì)胞蛋白的提取和免疫印跡雜交 提取細(xì)胞總蛋白，煮沸變性10 min，采用12% SDS-PAGE電泳分離50 μg細(xì)胞蛋白樣品，轉(zhuǎn)至PVDF膜后用特異的抗Nox4、Nox2/gp91phox及p-PKC抗體進(jìn)行免疫雜交檢測(cè)，β-actin作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1阿托伐他汀呈濃度依賴性下調(diào)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平

流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，高糖(25 mmol/L)干預(yù)8 h后內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加(8.04±0.45vs1.30±0.38，P<0.05)，甘露醇干預(yù)8 h未顯著增加細(xì)胞內(nèi)的ROS生成，阿托伐他汀呈濃度依賴性(10-8mol/L～10-6mol/L)地抑制高糖環(huán)境下 HUVECs內(nèi)ROS的生成，見(jiàn)圖1。熒光顯微鏡觀察結(jié)果也顯示，高糖干預(yù)使得內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)DHE產(chǎn)生的紅色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，阿托伐他汀(10-6mol/L)顯著降低高糖誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成，見(jiàn)圖2。

圖1阿托伐他汀抑制高糖環(huán)境下人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的水平

Figure 2. Effects of atorvastatin and PKC inhibitor on high glucose-induced ROS production in HUVECs.

圖2阿托伐他汀和PKC抑制劑抑制高糖環(huán)境下HUVECs內(nèi)ROS的水平

2阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制NADPH氧化酶活性

不同濃度(10-8mol/L～10-6mol/L)的阿托伐他汀預(yù)處理HUVECs 1 h后，再給予高糖干預(yù)8 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀呈濃度依賴性地抑制NADPH氧化酶的活性，見(jiàn)圖3。

3阿托伐他汀抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基的表達(dá)

阿托伐他汀呈濃度依賴性下調(diào)高糖誘導(dǎo)下Nox4(圖4A)和Nox2/gp91phox(圖4B)mRNA增加的幅度。10-7mol/L濃度阿托伐他汀干預(yù)時(shí)呈現(xiàn)出抑制效應(yīng), 10-6mol/L濃度阿托伐他汀的抑制作用較10-7mol/L濃度顯著增強(qiáng)。我們采用免疫印記雜交方法進(jìn)一步證實(shí)了阿托伐他汀對(duì)高糖環(huán)境下Nox4(圖4C)和Nox2/gp91phox(圖4D)亞基蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)。

4PKC參與高糖誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)

分別用2 μmol/L和20 μmol/L PKC抑制劑預(yù)處理HUVECs 45 min后，再進(jìn)行高糖干預(yù)。PKC抑制劑呈濃度依賴性(2～20 μmol/L)地抑制高糖環(huán)境下ROS的生成(圖5A)及NADPH氧化酶的活化(圖5B)，共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示20 μmol/L PKC可顯著降低高糖環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光強(qiáng)度(圖2)；同樣，20 μmol/L PKC抑制劑顯著抑制高糖誘導(dǎo)NADPH氧化酶Nox4(圖5C)和Nox2/gp91phox(圖5D)的表達(dá)

圖3阿托伐他汀抑制高糖環(huán)境下人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性

。

5阿托伐他汀抑制高糖誘導(dǎo)下PKC的活化

如圖6所示，10-8mol/L～10-6mol/L阿托伐他汀預(yù)處理HUVECs 1 h后，再暴露于高糖環(huán)境15 min，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的PKC的磷酸化水平。

討 論

糖尿病患者體內(nèi)具有較高的氧化應(yīng)激水平，氧化應(yīng)激參與血管內(nèi)皮細(xì)胞病理生理變化過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷也是動(dòng)脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)[1]。血管內(nèi)皮中氧化應(yīng)激損傷主要源于線粒體電子傳遞鏈、一氧化氮合酶、NADPH氧化酶等多種途徑產(chǎn)生的ROS，而NADPH氧化酶是內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS最主要的來(lái)源[2]。NADPH氧化酶作用的發(fā)揮有賴于其在胞漿中的亞基p47phox、p40phox、p67phox與胞膜上的亞基p22phox、Nox2/gp91phox結(jié)合并形成完整的有生物活性的NADPH氧化酶復(fù)合體。催化亞基Nox2/gp91phox和調(diào)節(jié)亞基p22phox在細(xì)胞膜上形成異二聚體(即黃素細(xì)胞色素b558)，位于胞漿的亞基可對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)[10-11]。我們前期研究已證實(shí)Nox4、p22phox和Nox2/gp91phox亞基參與高糖環(huán)境下HUVECs內(nèi)NADPH氧化酶的活化[9]。本研究中我們?cè)俅巫C實(shí)了高糖通過(guò)促進(jìn)NADPH氧化酶的活化上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，與前期結(jié)果一致。

他汀類藥物是目前臨床上用來(lái)控制血脂水平的一線用藥，是膽固醇生物合成過(guò)程中限速酶3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，能夠降低總膽固醇和低密度脂蛋白并升高高密度脂蛋白。

圖4阿托伐他汀抑制高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基的表達(dá)

圖5PKC抑制劑對(duì)高糖環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)ROS生成、NADPH氧化酶活性及NAPDH氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基表達(dá)的影響

圖6阿托伐他汀抑制高糖誘導(dǎo)的PKC磷酸化

許多研究表明他汀具有“非降脂相關(guān)的心血管保護(hù)作用”，主要包括抗氧化應(yīng)激作用、改善血管內(nèi)皮功能、抗炎等作用[12-14]，但其相關(guān)的分子機(jī)制依然值得探討。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能顯著下調(diào)高糖環(huán)境下Nox4和Nox2/gp91phox亞基的表達(dá)，且具有濃度依賴性，提示阿托伐他汀可對(duì)NADPH氧化酶的主要亞基進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。阿托伐他汀對(duì)NADPH氧化酶亞基表達(dá)水平的調(diào)控效應(yīng)可能是其在高糖環(huán)境下抑制NADPH氧化酶活性和下調(diào)ROS生成水平的重要機(jī)制之一。

PKC具有多種亞型，在靜息狀態(tài)下主要以無(wú)活性的狀態(tài)存在于胞漿中，是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞中的重要分子。PKC受到外界刺激時(shí)通過(guò)上游信號(hào)分子的磷酸化作用使其構(gòu)象改變而激活，是多條信號(hào)通路的交匯點(diǎn)。高濃度葡萄糖能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)PKC的激活[2]，而與之相伴的是細(xì)胞內(nèi)DAG水平的上升，其機(jī)制可能與高血糖促進(jìn)DAG從頭合成，而激活DAG-PKC通路有關(guān)。本研究應(yīng)用PKC抑制劑對(duì)HUVECs進(jìn)行干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)PKC參與了高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的ROS的生成、NADPH氧化酶的活化以及Nox2/gp91phox和Nox4亞基的表達(dá)。因此，PKC活化是高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)途徑之一，有望成為糖尿病條件下血管內(nèi)皮功能保護(hù)和動(dòng)脈粥樣硬化防治的重要靶點(diǎn)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀呈濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的PKC的活化，提示對(duì)PKC的抑制作用是阿托伐他汀對(duì)抗高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷的重要分子機(jī)制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)PKC的活化實(shí)現(xiàn)其在高糖環(huán)境中抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Nox2/gp91phox和Nox4亞基的表達(dá)、抑制NADPH氧化酶活性及下調(diào)ROS生成，從而對(duì)抗高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷。

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Atorvastatininhibitshighglucose-inducedoxidativestressbydepressingPKCactivityinhumanumbilicalveinendothelialcells

CHAI Da-jun, NING Ruo-bing, ZHU Jiang, XU Chang-sheng, XIE Hong, LIN Jin-xiu

(DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianHypertensionInstitute,Fuzhou350005,China.E-mail:caidajun@medmail.com.cn)

AIM: To explore the effect of atorvastatin on high glucose-induced oxidative stress and underlying mechanisms in human endothelial cells.METHODSHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured in medium 199 containing normal concentration of glucose (5.5 mmol/L). For high glucose treatment, glucose solution was added to the final concentration of 25 mmol/L. Reactive oxygen species (ROS) were detected by flow cytometry and confocal microscopy. The activity of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase was measured by lucigenin assay. Phosphorylated protein kinase C (PKC) and the expression levels of NADPH oxidase subunits Nox4 and Nox2/gp91phoxwere determined by quantitative real-time PCR and immunoblotting.RESULTSHigh glucose increased ROS production, NADPH oxidase activity and the expression of Nox4 and Nox2/gp91phoxsubunits. Treatment of endothelial cells with atorvastatin resulted in significant inhibition (in a concentration-dependent manner) of high glucose-induced ROS production, NADPH oxidase activation and the expression of Nox4 and Nox2/gp91phoxsubunits. PKC inhibitor showed a similar effect to that of atorvastatin on high glucose-induced oxidative stress. Furthermore, atorvastatin rapidly inhibited high glucose-induced activation of protein kinase C, an upstream activator of NADPH oxidase.CONCLUSIONPKC is involved in high glucose-induced oxidative stress in HUVECs. Atorvastatin inhibits high glucose-induced oxidative stress by depressing PKC activity in human endothelial cells.

High glucose; Oxidative stress; Statins; Protein kinase C

R543

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.001