李宏宇 李建軍 郭曉鐘 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志

·論著·

乏氧條件下PTEN、KAI1基因雙轉(zhuǎn)染對胰腺癌AsPC1細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響

李宏宇 李建軍 郭曉鐘 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志

目的觀察乏氧環(huán)境下PTEN和KAI1基因雙轉(zhuǎn)染人胰腺癌AsPC1細(xì)胞后對其增殖、遷移的影響。方法應(yīng)用我們前期構(gòu)建的PTEN和KAI1基因過表達(dá)載體同時轉(zhuǎn)染乏氧環(huán)境培養(yǎng)的人胰腺癌AsPC1細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN和KAI1蛋白的表達(dá)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞的增殖，克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞形成集落能力，Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果雙基因轉(zhuǎn)染后，乏氧培養(yǎng)的AsPC1細(xì)胞的PTEN、KAI1蛋白表達(dá)量較空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增加2.05倍及1.51倍；細(xì)胞增殖顯著減緩(0.5比0.8，P=0.000)；克隆形成數(shù)顯著下降[(41.67±5.03)個比(86.00±7.81)個，P=0.017)]；細(xì)胞遷移能力明顯減弱(0.68±0.05比1.23±0.03，P=0.003)。結(jié)論乏氧條件下PTEN、KAI1基因雙轉(zhuǎn)染AsPC1細(xì)胞后能夠抑制其增殖、遷移能力，基因聯(lián)合治療胰腺癌可能具有潛在的應(yīng)用價值。

胰腺腫瘤； 細(xì)胞系，腫瘤； 缺氧； 轉(zhuǎn)染

腫瘤組織內(nèi)部因血管分布不均一所造成供血供氧不足的乏氧狀態(tài)是腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，也是實(shí)體腫瘤中十分常見的現(xiàn)象[1]。研究表明，乏氧與腫瘤的抗凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及血管生成有關(guān)，可促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[2]，同時可降低放、化療及其他治療的效果[3]。本研究將抑癌基因PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromo-some ten)和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI1聯(lián)合轉(zhuǎn)染乏氧條件下的胰腺癌AsPC1細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖、遷移的影響，探討多基因聯(lián)合治療的意義。

材料和方法

一、PTEN和KAI1基因雙轉(zhuǎn)染

AsPC1細(xì)胞株為本科室保存。攜帶PTEN基因的pEAK8質(zhì)粒(pE-PTEN)和含有KAI1基因的腺病毒(Ad-KAI1)由我們前期構(gòu)建[4-5]。利用乏氧設(shè)備在完全密閉的方盒中持續(xù)通入乏氧氣體(1% O2、5% CO2和94% N2)，將處于對數(shù)生長期的AsPC1細(xì)胞在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)1周后接種到6孔板。采用Lipofectamine 2000(美國Invotrogen公司)將pE-PTEN和Ad-KAI1共同轉(zhuǎn)染AsPC1細(xì)胞(雙轉(zhuǎn)染組)，經(jīng)篩選后擴(kuò)增培養(yǎng)。以空質(zhì)粒pEAK8和腺病毒Ad轉(zhuǎn)染細(xì)胞(空轉(zhuǎn)染組)及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。

二、蛋白質(zhì)印跡法

取2×106個雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解后收集細(xì)胞總蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN及KAI1蛋白。PTEN抗體及KAI1抗體均購自美國Santa Cruz公司，以GAPDH作為內(nèi)參，最后ECL發(fā)光顯色，采用ImageJ軟件分析灰度值。以空轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照組。

三、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法

PTEN和KAI1雙轉(zhuǎn)染的AsPC1細(xì)胞接種到96孔板，每孔2×103個細(xì)胞，在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)5 d，每天取5個孔，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，4 h后吸出孔內(nèi)液體，加入DMSO 100 μl，5 min后測各孔490 nm的吸光值(A490值)。以空轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照組。以時間為橫坐標(biāo)，A490值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

四、克隆形成實(shí)驗(yàn)

將雙轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別接種6孔板，每孔200個細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)14 d，中途換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)終止時PBS洗滌細(xì)胞2次，多聚甲醛固定，PBS再洗滌2次，Giemsa染色10 min，去離子水洗滌3次，計數(shù)克隆并拍照。

五、Transwell小室實(shí)驗(yàn)

Transwell小室(美國Corning公司)的上室加入無血清培養(yǎng)液懸浮的雙轉(zhuǎn)染組或空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞2×104個，下室加入含30%胎牛血清的培養(yǎng)液，在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)8 h。倒扣小室于吸水紙上以去除培養(yǎng)液，用棉簽輕拭去小室上層非穿膜細(xì)胞，用Giemsa染色30 min，漂洗數(shù)次，顯微拍照后10%醋酸溶解，以570 nm的吸光值(A570值)代表細(xì)胞的遷移率。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染效果

雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的PTEN和KAI1蛋白表達(dá)水平明顯升高，分別為空轉(zhuǎn)染組的2.05倍及1.51倍，而空轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞的PTEN(a)和KAI1(b)蛋白表達(dá)

二、細(xì)胞增殖

雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖速率明顯減緩，從第2天起均較空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞顯著降低(P=0.000，圖2)。

圖2 雙轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長曲線

三、細(xì)胞克隆形成

雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成>50個細(xì)胞的克隆數(shù)為(41.67±5.03)個，空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的克隆數(shù)為(86.00±7.81)個，雙轉(zhuǎn)染組顯著低于空轉(zhuǎn)染組(P=0.017)。同時，顯微鏡下見雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成的單個克隆中的細(xì)胞數(shù)亦較空轉(zhuǎn)染組少(圖3)。

四、細(xì)胞遷移能力

雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力較空轉(zhuǎn)染組明顯降低(圖4)。雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移率為0.68±0.05，顯著低于空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的1.23±0.03(P=0.003)。

圖3 雙轉(zhuǎn)染組(a)及空轉(zhuǎn)染組(b)形成的細(xì)胞克隆

圖4 雙轉(zhuǎn)染組(a)及空轉(zhuǎn)染組(b)的穿膜細(xì)胞(×400)

抑癌基因PTEN是在1997年被分離出的繼P53后另一個較為廣泛與腫瘤關(guān)系密切的抑癌基因，位于10號染色體10q23.3，有9個外顯子和8個內(nèi)含子，是一個高度保守的基因。它調(diào)控細(xì)胞周期和增殖，抑制細(xì)胞的生長[6-8]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因可以使胰腺癌AsPC1細(xì)胞阻滯在G2/M期，增加乏氧可誘導(dǎo)AsPC1細(xì)胞凋亡以及放射線引起G2/M期細(xì)胞阻滯的能力，并且抑制AsPC1細(xì)胞在常氧及乏氧情況下的增殖[9-10]。1995年，KAI1/CD82 作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因首次從前列腺癌細(xì)胞系中分離出來，其屬于跨膜4超家族(TM4SF),編碼分子質(zhì)量29 6000的跨膜糖蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動、分化和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[11]。我們前期的研究結(jié)果顯示，KAI1基因與人胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。轉(zhuǎn)染KAI1基因后胰腺癌細(xì)胞生長受抑，遷移能力減弱；動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)KAI1質(zhì)粒注射治療的荷瘤鼠的瘤體積縮小，肝、肺的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目減少[12-14]。

我們以往的研究只顯示單一基因的作用，未能體現(xiàn)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的多基因聯(lián)合效應(yīng)，同時對影響胰腺癌預(yù)后和治療敏感性的乏氧環(huán)境也缺乏足夠的探討。本研究將PTEN和KAI1基因同時轉(zhuǎn)染ASPC1細(xì)胞，并在接近腫瘤自然生存環(huán)境的乏氧環(huán)境下培養(yǎng)。結(jié)果顯示，在乏氧條件下，PTEN和KAI1雙轉(zhuǎn)染后能夠抑制細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，降低細(xì)胞的遷移能力，顯示出可喜的應(yīng)用前景。筆者在此基礎(chǔ)上，將對放療敏感性及動物實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步驗(yàn)證，以提供更加有力的證據(jù)。

[1] Otrock ZK, Hatoum HA, Awada AH, et al．Hypoxia-inducible factor in cancer angiogenesis: structure, regulation and clinical perspectives. Crit Rev Oncol Hematol, 2009, 70:93-102．

[2] Hill RP, Marie-Eqyptienne DT, Hedley DW．Cancer stem cells,hypoxia and metastasis. Semin Radiat Oncol, 2009,19:106-111.

[3] Cosse JP, Michiels C．Tumour hypoxia affects the responsiveness of cancer cells to chemotherapy and promotes cancer progression．Anticancer Agents Med Chem, 2008, 8:790-797.

[4] 李宏宇, 于皆平, 郭曉鐘, 等. 體外轉(zhuǎn)染PTEN對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響. 中華內(nèi)科雜志, 2005, 44: 191-194.

[5] 張巍巍,郭曉鐘,王立生,等.KAI1復(fù)制缺陷型腺病毒載體抑制人胰腺癌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究.胰腺病學(xué),2006,6:131-134.

[6] Chu EC, Tarnawski AS. PTEN regulatory functions in tumor suppression and cell biology. Med Sci Monit, 2004, 10: RA235-RA241.

[7] Saito Y, Swanson X, Mhashilkar AM, et al. Adenovirus-mediated transfer of the PTEN gene inhibits human colorectal cancer growth in vitro and in vivo. Gene Ther, 2003,10: 1961-1969.

[8] Yamada KM, Araki M. Tumor suppressor PTEN: modulator of cell signaling, growth, migration and apoptosis. J Cell Sci, 2001, 114: 2375-2382.

[9] 李建軍, 李宏宇, 陳延治, 等. 外源性PTEN增強(qiáng)乏氧誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞ASPC-1凋亡. 中華腫瘤雜志, 2006, 28:33-36.

[10] 李宏宇, 于皆平, 郭曉鐘, 等. 染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源物對胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞周期和增殖能力的影響. 中華消化雜志，2005, 25:162-165.

[11] Sridhar SC, Miranti CK. Tetraspanin KAI1/CD82 suppresses invasion by inhibiting integrin-dependent crosstalk with c-Met receptor and Src kinases. Oncogene, 2006,25:2367-2378.

[12] 郭曉鐘, 徐建華, 劉民培, 等. KAI1基因抑制胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討. 中華內(nèi)科雜志, 2004, 43: 360-362.

[13] 徐建華, 郭曉鐘, 劉民培, 等. KAI1基因轉(zhuǎn)染的胰腺癌細(xì)胞系的建立. 胰腺病學(xué),2004, 4:141-144.

[14] 郭曉鐘, 劉民培, 夏玉亭,等. KAI1基因與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系. 中華內(nèi)科雜志, 2000,39:626.

EffectsofPTENandKAI1doublegenetransfectiononproliferation,metastasisonpancreaticcancerAsPC1cellsunderhypoxiccondition

LIHong-yu,LIJian-jun,GUOXiao-zhong,LIUXu,WUChun-yan,ZHAOJia-jun,CHENYan-zhi.
DepartmentofGastroenterology,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110840,China

GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of PTEN and KAI1 double gene transfection on proliferation, metastasis in AsPC1 pancreatic cancer cells under hypoxic condition.MethodsRecombinant vectors that over expressing PTEN and KAI1 protein which was established previously were double transfected into hypoxic AsPC1 cells. Western blot was performed to measure the expression level of PTEN and KAI1. Then, cell proliferation was detected by MTT, and colony forming assay were used to test the ability of tumor cells forming colonies, and transwell assay was used to evaluate metastatic function.ResultsAfter double gene transfection, both PTEN and KAI1 protein expression was significantly up-regulated, which was 2.05 and 1.51 folds higher than that of empty vector group; and cell proliferation of hypoxic AsPC1 cells was suppressed significantly (0.5vs0.8,P=0.00031), number of colony formation was significantly decreased [(41.67±5.03)vs(86.00±7.81),P=0.017)]; the capacity of metastasis was significantly decreased (0.68±0.05vs1.23±0.03,P=0.0025).ConclusionsDouble gene transfection of PTEN and KAI1 could inhibit proliferation and metastatic activity of hypoxic AsPC1 cells, which might indicate that combined gene therapy may play a role in the treatment of pancreatic cancer.

【Keywrods】 Pancreatic neoplasms; Cell line, tumor; Anoxia; Transfection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.014

遼寧省博士啟動基金(20081044)；遼寧省教育廳基金(L2010627)

110840 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科(李宏宇、郭曉鐘、劉旭、吳春燕、趙佳鈞)；中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科(李建軍、陳延志)

郭曉鐘，Email: guoxiaozhong1962@163.com

2011-06-28)

(本文編輯：呂芳萍)