楊立新 楊紅 李景南 郝建宇 錢家鳴

·論著·

抑癌基因ppENK甲基化在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用

楊立新 楊紅 李景南 郝建宇 錢家鳴

目的檢測(cè)胰腺組織ppENK 基因甲基化狀態(tài)，探討ppENK基因甲基化在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法采用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)胰腺癌組織、胰腺癌細(xì)胞株、正常胰腺組織中ppENK基因甲基化狀態(tài)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。RT-PCR法檢測(cè)組織及細(xì)胞ppENK mRNA表達(dá)。應(yīng)用去甲基化藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理胰腺癌細(xì)胞株(PANC1、AsPC1)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNMT3a)蛋白表達(dá)。結(jié)果正常胰腺組織表達(dá)ppENK mRNA，基因非甲基化。胰腺癌組織ppENK基因甲基化率為90.3%(28/31)，ppENK基因甲基化與臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。SW1990、PANC1、PC3、AsPC1、PuPan-1胰腺癌細(xì)胞株均無(wú)ppENK mRNA表達(dá)，基因均表現(xiàn)為甲基化，ppENK mRNA表達(dá)與其甲基化呈負(fù)相關(guān)。5-Aza-dC處理后，PANC1、AsPC1細(xì)胞的ppENK基因被去甲基化，ppENK mRNA恢復(fù)表達(dá)；細(xì)胞的增殖呈濃度依賴性被抑制；細(xì)胞凋亡率增加[(31.57±6.76)%比(3.21±1.43)%，P=0.002，(16.6±8.22)%比(3.82±1.71)%，P=0.058]；DNMT3a表達(dá)減少；PANC1的G1期細(xì)胞比例顯著增加[(67.87±2.72)%比(54.57±7.18)%，P=0.040],S期細(xì)胞比例顯著減少[(22.37±4.31)%比(33.73±4.63)%，P=0.036]，AsPC1的G1期、S期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P=0.236、0.075)。結(jié)論ppENK基因甲基化是引起ppENK表達(dá)抑制的重要分子事件。ppENK基因去甲基化后可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，細(xì)胞周期被阻滯在G1期，DNMT3a蛋白表達(dá)減少。

胰腺腫瘤； 前腦啡肽原基因； DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a； 甲基化

某些基因異常甲基化是腫瘤發(fā)生過(guò)程中一個(gè)較早的分子事件。隨著對(duì)DNA甲基化研究的深入，發(fā)現(xiàn)那些因甲基化狀態(tài)改變而失活的基因序列并未改變，那么改善其甲基化狀態(tài)有可能使基因恢復(fù)表達(dá)而作為新的治療靶點(diǎn)[1]。前腦啡肽原基因(preproenkephalin，ppENK),也稱前腦啡肽原A，是有研究前景的與胰腺癌相關(guān)的抑癌基因。本研究檢測(cè)胰腺癌組織及細(xì)胞株ppENK甲基化狀態(tài)，并應(yīng)用去甲基化藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理胰腺癌細(xì)胞株，觀察其對(duì)細(xì)胞ppENK基因表達(dá)、甲基化狀態(tài)、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNMT3a)表達(dá)的影響。

材料和方法

一、DNA提取及甲基化修飾

32例胰腺癌標(biāo)本來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、浙江醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。組織塊切片、HE染色后用5 ml注射器針頭在顯微鏡下精確取少許胰腺癌組織，置TE+0.5%Tween20緩沖液中，37℃孵育72 h，95℃ 10 min滅活蛋白酶K，常規(guī)提取DNA。人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、AsPC1、PC3、PuPan-1、SW1990購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)(ATCC)，常規(guī)培養(yǎng)，提取細(xì)胞DNA。應(yīng)用甲基化修飾試劑盒(Intergen公司)行甲基化修飾，按說(shuō)明書操作。

二、ppENK基因甲基化及mRNA 表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)法檢測(cè)ppENK基因甲基化。ppENK非甲基化引物上游5′-TTGTGTGGGGAGTTATTGAGT-3′，下游5′-CACCTTCACAAAAAAAATCAATC-3′，產(chǎn)物100 bp；ppENK甲基化引物上游5′-TGTGGG-GAGTTATCGAGC-3′，下游5′-GCCTTCGCGAAAAAA-ATCG-3′，產(chǎn)物96 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 13 min，94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 3 min，45個(gè)循環(huán)。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)ppENK mRNA表達(dá)。ppENK引物上游5′-CCGAATGCAGCCAGGATTG-3′，下游5′-GTGCTGGTGCCATCTTGAG-3′，產(chǎn)物179 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s；循環(huán)35次；最終72℃ 10 min；MSP反應(yīng)條件：94℃ 13 min；94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 30 s；最終72℃ 3 min。

三、細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖。取1×103個(gè)PANC1、ASPC1細(xì)胞分別接種于96孔板，培養(yǎng)液中分別含0(對(duì)照)、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L 5-Aza-dC，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)1～7 d。每天分別加入10 μl 10 mg/ml MTT孵育4 h后吸出上清液，加入150 μl DMSO充分振蕩，在酶標(biāo)儀上測(cè)490 nm的吸光度值(A490值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

四、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。AsPC1、PANC1細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%融合時(shí)加入1 μmol/L 5-Aza-dC，以不加5-Aza-dC作為對(duì)照。培養(yǎng)5 d后收獲細(xì)胞，PBS洗3遍后用70%乙醇5 ml 4℃固定過(guò)夜，PBS洗兩遍，加1 mg/ml RNaseA 37℃ 孵育30 min，再加20 μg/ml PI 4℃ 放置1 h。上流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)凋亡細(xì)胞百分率和細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

五、細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，按常規(guī)方法操作。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、正常胰腺組織、胰腺癌細(xì)胞株ppENK mRNA表達(dá)及其甲基化狀態(tài)

正常胰腺組織表達(dá)ppENK mRNA，而SW1990、PANC1、PC3、AsPC1、PuPan-1胰腺癌細(xì)胞株均無(wú)ppENK mRNA表達(dá)(圖1)。

圖1正常胰腺組織(1)及胰腺癌細(xì)胞株(2～6)ppENK mRNA表達(dá)

正常胰腺組織ppENK為非甲基化，而5株胰腺癌細(xì)胞株均出現(xiàn)甲基化(圖2)。

圖25株胰腺癌細(xì)胞株ppENK甲基化狀態(tài)

二、胰腺癌組織ppENK甲基化狀態(tài)及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

31例胰腺癌組織中28例有甲基化，甲基化率為90.3%(圖3)。胰腺癌組織ppENK甲基化與其臨床病理特征均無(wú)相關(guān)性(表1)。

M：甲基化產(chǎn)物；U：非甲基化產(chǎn)物

圖3胰腺癌組織ppENK基因不完全甲基化(1)、甲基化(2)及非甲基化(3)狀態(tài)

表1 胰腺癌ppENK甲基化與其臨床病理特征的關(guān)系

注：OR值即下/上相比得到ppENK甲基化的概率

三、5-Aza-dC對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

5-Aza-dC處理后，AsPC1、PANC1細(xì)胞的增殖均被抑制，且呈濃度依賴性(表2)。

四、5-Aza-dC對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)5-Aza-dC處理后，PANC1細(xì)胞凋亡率顯著增加[(31.6±6.8)%比(3.2±1.4)%，P=0.002]；AsPC1細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著增加[(16.6±8.2)%比(3.8±1.7)%，P=0.058)]。

表2 各組AsPC1、PANC1細(xì)胞的A490值

注：與0 μmol/L對(duì)照組比較，aP<0.05

五、5-Aza-dC對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期的影響

PANC1、AsPC1的G1期細(xì)胞比例分別為(54.57±7.18)%、(52.43±3.46)%，S期細(xì)胞為(33.73±4.63)%、(35.20±0.85)%；5-Aza-dC處理后，PANC1、AsPC1的G1期細(xì)胞比例分別為(67.87±2.72)%、(61.20±10.35)%，S期細(xì)胞為(22.37±4.31)%、(27.27±5.67)%，其中PANC1的G1期細(xì)胞比例較未處理組顯著增加(P=0.04)，S期細(xì)胞比例顯著降低(P=0.036)，而AsPC1的細(xì)胞周期無(wú)明顯變化(P=0.236、0.075)。

六、5-Aza-dC對(duì)胰腺癌細(xì)胞ppENK mRNA表達(dá)、甲基化狀態(tài)、DNMT3a表達(dá)的影響

PANC1、AsPC1細(xì)胞不表達(dá)ppENK mRNA；5-Aza-dC處理后，PANC1、AsPC1細(xì)胞均恢復(fù)ppENK mRNA的表達(dá)，表達(dá)量分別為0.117±0.056、0.336±0.092(圖4)，且均未檢測(cè)到ppENK甲基化條帶(圖5),同時(shí)細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)明顯減少。

圖4正常胰腺(1)、5-Aza-dC處理前后AsPC1(2、3)、PANC1(4、5)及陰性對(duì)照(6)的ppENK mRNA表達(dá)

M：甲基化產(chǎn)物；U：非甲基化產(chǎn)物

圖55-Aza-dC處理后AsPC1(1)、PANC1(2)及胰腺癌組織(3)ppENK甲基化狀態(tài)

討 論

ppENK長(zhǎng)約5.2kb，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，位于8號(hào)染色體。它編碼的甲硫氨酸-腦啡肽(met-enkephalin)由267個(gè)氨基酸組成，能夠在體內(nèi)和體外條件下抑制包括結(jié)腸癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、腎癌、卵巢癌和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等腫瘤生長(zhǎng)，是有研究前景的與胰腺癌相關(guān)的抑癌基因[2-5]。

本研究顯示，胰腺癌組織ppENK甲基化率高達(dá)90.3%，5株胰腺癌細(xì)胞株ppENK基因亦均表現(xiàn)為甲基化，高甲基化的胰腺癌組織或細(xì)胞株均無(wú)ppENK mRNA表達(dá)。而正常胰腺組織的ppENK基因無(wú)甲基化，高表達(dá)ppENK mRNA。提示ppENK甲基化狀態(tài)是引起其不表達(dá)的重要分子事件。

胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1分化程度較高，而AsPC1分化低，轉(zhuǎn)移能力高。給予5-Aza-dC處理后，兩株細(xì)胞的生長(zhǎng)均被抑制，且無(wú)明顯差異。5-Aza-dC處理后，兩株細(xì)胞的凋亡率均增加，但PANC1細(xì)胞凋亡的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而AsPC1細(xì)胞凋亡的增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PANC1細(xì)胞G1期比例增加，S期比例減少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而AsPC1細(xì)胞周期比例的變化與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因可能為胰腺癌細(xì)胞株存在異質(zhì)性的緣故。

5-Aza-dC處理后，細(xì)胞ppENK甲基化被逆轉(zhuǎn)，但未能達(dá)到完全去甲基化。ppENK mRNA表達(dá)則有不同程度的逆轉(zhuǎn)。若增加5-Aza-dC劑量或許會(huì)取得更為理想的效果。

Dnmt3a是主要的從頭甲基化酶，在很多癌變組織表達(dá)增加，且發(fā)生在DNA甲基化之前，可能是引起DNA甲基化異常的原因。本研究顯示,PANC1、AsPC1細(xì)胞表達(dá)DNMT3a，給予5-Aza-dC處理后，DNMT3a蛋白表達(dá)較給藥前明顯減弱，提示DNMT3a在ppENK基因甲基化中可能起了重要作用[6-7]。

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MethylationstatusoftumorsuppressorgeneppENKinthepathogenesisofpancreaticcarcinoma

YANGLi-xin,YANGHong,LIJing-nan,HAOJian-yu,QIANJia-ming.
DepartmentofGastroenterology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China

QIANJia-ming,Email：yuanjiah@263bj.com

ObjectiveTo detect the methylation status of ppENK and its role in the pathogenesis of pancreatic carcinoma.MethodsThe ppENK methylation status in human tissues of pancreatic cancer, pancreatic carcinoma cell lines and normal pancreas was detected by methylation-specific RT-PCR(MSP). The association of methylation status of ppENK gene with clinicopathological parameters was analyzed. The expression of ppENK mRNA was detected by RT-PCR. Two pancreatic carcinoma cell lines (PANC1, AsPC1) were treated with demethylating agent (5-aza-dC). The cell growth was measured by MTT. Apoptosis and cell cycle was analyzed by flow cytometry. The expression of DNMT3a was measured by Western blot.ResultsppENK mRNA was expressed in normal pancreas. And methylation of ppENK was not detected in normal pancreas. Methylation of ppENK was detected in 90.3%(28/31) of pancreatic carcinoma tissue, and there were no correlation between methylated ppENK with clinicopathological features of pancreatic carcinoma. There was no ppENK mRNA expression in SW1990, PANC1, PC3, AsPC1, PuPan-1, and ppENK was methylated. Methylated ppENK was associated with no ppENK mRNA expression. After 5-Aza-dC treatment, PANC1, AsPC1 was demethylated and ppENK mRNA expression was reversed. The proliferation of PANC1 and AsPC1 was inhibited in a dose dependent manner. The apoptotic rates of PANC1 and AsPC1 were increased [(31.57±6.76)%vs(3.21±1.43)%,P=0.002, (16.6±8.22)%vs(3.82±1.71)%,P=0.058]；the expression of DNMT3a protein was decreased; the PANC1 cells of G1phase significantly increased [(67.87±2.72)%vs(54.57±7.18)%,P=0.040], but PANC1 cells of S phase significantly decreased [(22.37±4.31)%vs(33.73±4.63)%,P=0.036]. But the percentage of G1, S phase in AsPC1 cell line was not significantly changed (P=0.236, 0.075).ConclusionsppENK demethylation is an important molecular event in inducing ppENK expression inhibition, which can inhibit pancreatic cancer proliferation, promote apoptosis, arrest cell cycle at G1and decrease the expression of DNMT3a protein.

Pancreatic neoplasms; ppENK； DNMT3a; Methylation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.012

100020 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院消化科(楊立新、郝建宇)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 北京協(xié)和醫(yī)院消化科(楊紅、李景南、錢家鳴)

錢家鳴，Email：yuanjiah@263bj.com

2011-10-31)

(本文編輯：屠振興)