朱亮 徐勝南 龐慧芳 趙慧貞 覃華 黎培員 李德民 趙秋

·論著·

缺氧對胰腺癌PANC1細胞增殖、凋亡及遷移的影響

朱亮 徐勝南 龐慧芳 趙慧貞 覃華 黎培員 李德民 趙秋

目的探討氯化鈷(CoCl2)模擬缺氧對人胰腺癌細胞株PANC1增殖、凋亡和遷移的影響。方法分別用終濃度為0(對照)、100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理PANC1細胞24 h，采用實時定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法分別檢測細胞缺氧誘導因子(HIF)-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA及蛋白的表達，采用CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力。結(jié)果對照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組HIF-1α mRNA表達量分別為 1、1.08±0.12、1.12±0.09、1.04±0.11、0.66±0.07；VEGF mRNA表達量分別為1、2.69±0.35、4.81±0.54、2.19±0.21、0.79±0.08；HIF-1α蛋白表達量為0.23±0.03、0.36±0.04、1.15±0.11、1.08±0.09、0.44±0.04；VEGF蛋白表達量為0.14±0.02、0.12±0.01、0.95±0.09、0.87±0.09、0.55±0.06；細胞存活率分別為100%、(98.43±2.88)%、(76.15±0.70)%、(53.87±0.77)%、(35.23±0.67)%；細胞凋亡率分別為(5.2±1.12)%、(5.74±1.07)%、(6.82±1.85)%、(12.09±3.53)%、(31.88±6.95)%；細胞爬行距離分別為(43.24±3.67)%、(59.46±5.39)%、(80.56±8.05)%、(63.89±5.96)%、(9.09±1.59)%。與對照組相比較，處理組細胞VEGF mRNA、VEGF及HIF-1α蛋白表達、細胞爬行距離均呈先上升后下降的趨勢(P<0.05)，HIF-1α mRNA 表達、細胞增殖率呈劑量依賴性降低，細胞凋亡率呈劑量依賴性升高。結(jié)論CoCl2達到一定濃度時可顯著抑制PANC1細胞增殖，促進細胞凋亡；CoCl2對PANC1細胞遷移效應的雙向作用與高濃度CoCl2對細胞直接損傷有關。

胰腺腫瘤； 缺氧； 氯化鈷； 細胞增殖； 細胞凋亡； 細胞運動

研究表明，大多數(shù)實體瘤內(nèi)部微環(huán)境處于缺氧狀態(tài)，且這種缺氧環(huán)境是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一。氯化鈷(CoCl2)是一種化學制劑，由于其特殊的化學性能，常用于體外誘導化學缺氧，并在細胞增殖、遷移、應激反應等研究中廣泛應用。本研究通過CoCl2體外化學反應模擬缺氧環(huán)境，觀察其對人胰腺癌細胞系PANC1增殖、凋亡及遷移的影響。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)及分組

人胰腺癌細胞系PANC1由本院肝病研究所保存。解凍后置含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。分別應用終濃度為0(對照)、100、200、400、800 μmol/L的CoCl2(美國Sigma公司)干預細胞24 h。

二、mRNA表達檢測

取上述分組培養(yǎng)的細胞，采用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量PCR擴增。引物序列：細胞缺氧誘導因子(HIF)-1α上游5′-TGAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，下游5′-TTCACAAATCAGCACCAAGC-3′，擴增片段164 bp；VEGF上游5′-AACCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3′，下游5′-TTCACCACTTCGTGATGATTCTG-3′， 擴增片段129 bp；內(nèi)參β-actin上游5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游5′-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3′，擴增片段157 bp。PCR反應條件：95℃ 60 s, 95℃ 15 s、60℃ 30 s， 40個循環(huán)。mRNA相對表達量用2-ΔΔCt計算，ΔCt=Ct處理組-Ct對照組。以對照組mRNA表達量為1。

三、蛋白表達檢測

取上述分組培養(yǎng)的細胞，采用RIPA蛋白裂解液裂解，提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法。兔抗人HIF-1α、VEGF、β-actin多抗分別購自美國Santa Cruz公司、武漢博士德公司、美國Proteintech公司，工作濃度分別為1∶400、1∶400、1∶1000，最后ECL發(fā)光。用BioDoc-It 220凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)以及ImageJ分析軟件對圖像條帶作半定量分析。

四、細胞增殖檢測

取對數(shù)生長期PANC1細胞，按每孔1×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞生長至60%融合度時分成上述各組培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK-8(日本Dojindo公司)，避光培養(yǎng)2 h。每個濃度設5個復孔。在酶標儀上測定450 nm波長的吸光度(A450值)，以對照組細胞存活率為100%，細胞存活率=實驗組A450值/對照組A450值×100%。

五、細胞凋亡檢測

取上述各組培養(yǎng)的細胞，PBS洗2次后用培養(yǎng)液制備單細胞懸液。收集5×105個細胞，按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)說明書操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

六、細胞遷移試驗

取對數(shù)生長期PANC1細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞長滿孔板時，取黃色槍頭(200 μl)尖垂直板底制造人工劃痕，記錄初始劃痕距離。PBS洗2遍后加入無血清培養(yǎng)基，并分成上述各組培養(yǎng)24 h，記錄劃痕距離。細胞爬行距離=細胞爬行距離/初始劃痕距離×100%。

七、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、PANC1細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達的變化

對照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組HIF-1α mRNA相對表達量分別為1、1.08±0.12、1.12±0.09、1.04±0.11、0.66±0.07，800 μmol/L組細胞HIF-1α mRNA表達較對照組顯著降低(F=70.776，P<0.05)，其他各組表達無顯著改變；VEGF mRNA相對表達量分別為1、2.69±0.35、4.81±0.54、2.19±0.21、0.79±0.08，100、200、400 μmol/L組均較對照組顯著升高(F=20.280、195.323、240.833，P值均<0.05)，其中200 μmol/L組達峰值，800 μmol/L組恢復到正常水平，呈先上升后下降趨勢。

二、PANC1細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達的變化

對照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組HIF-1α蛋白相對表達量分別為0.23±0.03、0.36±0.04、1.15±0.11、1.08±0.09、0.44±0.04；VEGF蛋白表達量分別為0.14±0.02、0.12±0.01、0.95±0.09、0.87±0.09、0.55±0.06(圖1)。≥200 μmol/L各組均較對照組顯著升高(F=195.323、240.833、52.920；231.565、188.082、126.075；P值均<0.05)，其中200 μmol/L組達峰值，呈先上升后下降趨勢。

圖1 各組PANC1細胞HIF-1α 、VEGF蛋白的表達

三、PANC1細胞增殖的變化

對照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組細胞存活率分別為100%、(98.43±2.88)%、(76.15±0.70)% 、(53.87±0.77)%、(35.23±0.67)%，呈濃度依賴性抑制細胞增殖?！?00 μmol/L各組較對照組顯著下降(F=3454.390、89391.356、38591.953，P值均<0.05)。且各組間存活率差異均具有統(tǒng)計學意義(F=2607.256、2628.763,P值均<0.01)。

四、PANC1細胞凋亡的變化

對照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組細胞凋亡率分別為(5.2±1.12)%、(5.74±1.07)%、(6.82±1.85)%、(12.09±3.53)%、(31.88±6.95)%(圖2)。400、800 μmol/L組細胞凋亡率較對照組顯著升高(F=10.384,43.091,P值均<0.05)， 400 μmol/L組以早期凋亡為主，800 μmol/L組以晚期凋亡為主。

圖2 各組PANC1細胞的凋亡

五、PANC1細胞遷移的變化

對照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組細胞爬行距離分別為(43.24±3.67)%、(59.46±5.39)%、(80.56±8.05)%、(63.89±5.96)%、(9.09±1.59)%(圖3)。100、200、400 μmol/L組均較對照組顯著增加(F=18.562、53.383、26.113，P值均<0.05)，其中200 μmol/L組達峰值，而800 μmol/L組較對照組顯著減少(F=218.708,P<0.05)，呈先上升后下降趨勢。

圖3 各組PANC1細胞遷移的變化

討 論

在實體腫瘤中，由于腫瘤細胞生長失控、新生血管結(jié)構(gòu)紊亂、供給血管和腫瘤生長不相適應，腫瘤內(nèi)部往往處于缺血缺氧狀態(tài)，進而導致腫瘤對化療和放療抵抗[1]。另一方面，腫瘤可通過一系列生物學活性變化在缺氧環(huán)境下生存，其中缺氧誘導因子HIF-1α的激活是維持腫瘤細胞存活的重要因素之一。HIF-1α可通過調(diào)控多種靶基因如VEGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運子(GLUT) 等表達促進新生血管生成，調(diào)控腫瘤能量代謝以逃避或適應相對低氧環(huán)境，促進腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[2]。

使用CoCl2模擬缺氧是各種實驗性缺氧培養(yǎng)研究中經(jīng)常使用的方法。Co2+是鐵螯合酶的底物，可替代氧感受器血紅素中的Fe2+，阻斷氧感受器與氧結(jié)合，從而模擬缺氧狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，在CoCl2模擬的輕度缺氧模型下(≤200 μmol/L)，HIF-1α mRNA表達未見顯著升高，而HIF-1α蛋白及其靶基因VEGF表達水平升高，提示缺氧誘導的HIF-1表達主要在轉(zhuǎn)錄后水平，這與Guo等[3]在神經(jīng)元中的研究結(jié)果一致。但在較高CoCl2濃度水平(800 μmol/L)時，HIF-1α mRNA及蛋白表達水平均顯著下降，這可能與高濃度CoCl2對細胞直接損傷效應有關，這種損傷效用可能與其所誘發(fā)的絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活化有關[4]。

目前研究表明，HIF-1α在缺氧誘導的細胞凋亡中起著雙重作用，其發(fā)揮促凋亡或者抑凋亡作用取決于缺氧程度。在輕度缺氧時，HIF-1α可通過誘導抗凋亡蛋白IAP-2表達，并抑制促凋亡蛋白Bax表達從而抑制凋亡[5]；當細胞處于嚴重缺氧狀態(tài)時，HIF-1α通過穩(wěn)定p53蛋白促進腫瘤細胞凋亡[6]。本結(jié)果也顯示，在CoCl2≤200 μmol/L時，PANC1細胞的凋亡率無顯著變化，同時伴有HIF-1α 蛋白表達水平升高，提示HIF-1α可能在輕度缺氧條件下參與了對細胞的保護；而在CoCl2≥400 μmol/L時，細胞凋亡率較對照組顯著升高，同時伴有HIF-1α表達下降，這與之前物理缺氧的研究結(jié)果有所不同[6]，提示CoCl2本身對細胞的損傷效應可能干擾了其所誘導的缺氧對細胞的作用。

最新研究發(fā)現(xiàn)，缺氧在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，其中HIF-1α起著關鍵的介導作用[7-9]。有研究表明,HIF-1α可通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達上調(diào)從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。研究還表明，缺氧狀態(tài)下HIF-1α可與TGF-β或Notch通路共同作用誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而促進腫瘤細胞遷移[8-9]。本實驗結(jié)果顯示，CoCl2模擬缺氧對PANC1細胞遷移的作用呈現(xiàn)雙向性，與HIF-1α蛋白表達的變化趨勢一致，提示HIF-1α可能與缺氧促胰腺癌PANC1細胞遷移的作用有關，但在嚴重缺氧時，細胞遷移率反而降低，同時HIF-1α蛋白表達下降，這可能是CoCl2本身對細胞損傷效應的表現(xiàn)。

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Effectsofcobaltchloridemimetichypoxiaontheproliferation,apoptosisandmigrationofhumanpancreaticcancercelllinePANC1

ZHULiang,XUSheng-nan,PANGHui-fang,ZHAOHui-zhen,QINHua,LIPei-yuan,LIDe-min,ZHAOQiu.
DepartmentofGastroenterology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

ZHAOQiu,Email:zhaoqiu@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the influence of cobalt chloride (CoCl2)-mimetic hypoxia on the proliferation, apoptosis and migration of human pancreatic cancer cell line PANC1.MethodsPANC1 cells were treated with 0(control), 100, 200, 400, 800 μmol/L CoCl2respectively for 24 h. Real-time RT-PCR and Western blot were used to determine hypoxia induced factor (HIF)-1α mRNA and protein expression respectively, and cell counting kit-8(CCK-8) assays, flow cytometry and cell scratch test were used to examine the proliferation, apoptosis and migration of PANC1 cells, respectively.ResultsIn the control group and 100, 200, 400 and 800 μmol/L CoCl-2 groups, the expressions of HIF-1α mRNA were 1, 1.08±0.12, 1.12±0.09, 1.04±0.11, 0.66±0.07, and the expressions of VEGF mRNA were 1, 2.69±0.35, 4.81±0.54, 2.19±0.21, 0.79±0.08, while the expressions of HIF-1α protein were 0.23±0.03, 0.36±0.04, 1.15±0.11, 1.08±0.09, 0.44±0.04; and the expressions of VEGF protein were 0.14±0.02, 0.12±0.01, 0.95±0.09, 0.87±0.09, 0.55±0.06; and cell viability rates were 100%, (98.43±2.88)%, (76.15±0.70)%, (53.87±0.77)%, (35.23±0.67)%; while cell apoptotic rates were (5.2±1.12)%, (5.74±1.07)%, (6.82±1.85)%, (12.09±3.53)%, (31.88±6.95)%; the cell migration distance of PANC1 cells were (43.24±3.67)%, (59.46±5.39)%, (80.56±8.05)%, (63.89±5.96)%, (9.09±1.59)%. Compared with those of control group, the expressions of VEGF mRNA, VEGF and HIF-1α protein, cell migration distance showed a two-way variation (ascending first and descending later) (P<0.05), and the expression of HIF-1α mRNA and cell proliferation rate was decreased in a dose-dependent manner, while the cell apoptosis was increased in a dose-dependent manner.ConclusionsCoCl2significantly inhibits the proliferation and promotes apoptosis of PANC1 cells at certain level. CoCl2has a two-way effect on the migration of PANC1 cells, and it may be related to the direct injury of high concentration of CoCl2on cells.

Pancreatic neoplasms; Anoxia; Cobalt chloride; Cell proliferation; Apoptosis; Cell movement

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.011

430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院消化內(nèi)科(朱亮、徐勝南、龐慧芳、趙慧貞、覃華、黎培員、李德民、趙秋)；南昌大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(朱亮)

趙秋，Email: zhaoqiu@medmail.com.cn

2011-11-25)

(本文編輯：呂芳萍)