邵葉波 靳大勇 戎葉飛 許雪峰

·論著·

沉默小鼠成纖維細(xì)胞活化蛋白表達(dá)對(duì)原代胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

邵葉波 靳大勇 戎葉飛 許雪峰

目的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默小鼠胰腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的成纖維活化蛋白(FAP)表達(dá)，觀察其對(duì)小鼠原代胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法構(gòu)建靶向小鼠FAP基因的重組表達(dá)質(zhì)粒siFAP及對(duì)照質(zhì)粒siMOCK，分別轉(zhuǎn)染小鼠原代胰腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞mPCa-FCs-1212，采用定量RT-PCR法及蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FAP mRNA及蛋白表達(dá)。將該細(xì)胞與小鼠原代胰腺癌細(xì)胞mPCa-1212按1∶1的比例共培養(yǎng)，應(yīng)用MTT比色法檢測mPCa-1212細(xì)胞的增殖抑制率，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒siFAP的mPCa-FCs-1212細(xì)胞的FAP mRNA及蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒siMOCK的細(xì)胞的表達(dá)明顯下調(diào)[0.584±0.029比1.052±0.281，P=0.0213；(27.18±3.23)%比(61.58±4.72)%，P=0.0317]。轉(zhuǎn)染siFAP和轉(zhuǎn)染siMOCK的mPCa-FCs-1212分別與mPCa-1212細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后，mPCa-1212的增殖抑制率分別為(23.02±3.32)%和(1.11±0.23)%；細(xì)胞凋亡率分別為(42.31±5.34)%和(7.38±2.09)%，兩組細(xì)胞的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.000)。結(jié)論沉默F(xiàn)AP基因的mPCa-FCs-1212在體外可有效抑制mPCa-1212細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是一種潛在的基因治療新方法。

RNA，小分子干擾； 基因沉默； 成纖維細(xì)胞活化蛋白； 胰腺腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)是一種僅在惡性上皮腫瘤間質(zhì)中表達(dá)的Ⅱ型膜抗原，其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[1]。我們前期成功構(gòu)建了FAP的真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其在C57BL/6小鼠體內(nèi)外均可順利表達(dá)[2]。本研究采用RNA干擾(RNA interfernce，RNAi)技術(shù)沉默小鼠胰腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(mPCa-FCs-1212)FAP基因，觀察其對(duì)小鼠原代胰腺癌細(xì)胞(mPCa-1212)的增殖和凋亡的影響。

材料與方法

一、siRNA載體的構(gòu)建

[3]所示的序列和方法，采用化學(xué)合成法合成針對(duì)小鼠FAP基因的shRNA。它的單鏈DNA模板組成元件為5′端的BamHⅠ酶切位點(diǎn)+siRNA靶向沉默序列+環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列TTGATATCCG+siRNA反向互補(bǔ)序列+U6啟動(dòng)子終止序列TTTTTT+3′端的HindⅢ酶切位點(diǎn)。靶向FAP的siRNA(siFAP)序列為5′-AAGCTCTGGCGATATTCATAC-3′；陰性對(duì)照的隨機(jī)siRNA(siMOCK)序列為5′-CTACCGTTGTTATAGGTGT-3′。 引物由上海生工生物工程公司合成。先將正、反向寡核苷酸序列經(jīng)95℃加熱、退火至室溫，獲得雙鏈siRNA插入片段，將siFAP、siMOCK插入片段、質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo分別進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過凝膠回收試劑盒(博大泰克公司)回收純化后，于16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，取100 μl菌液涂布于氨芐青霉素抗性的選擇性培養(yǎng)基平板，置37℃培養(yǎng)過夜。分別挑選出含有siFAP及siMOCK重組子pRNT-U6-siFAP、pRNT-U6-siMOCK的大腸桿菌克隆，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切及DNA測序驗(yàn)證。DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選以及與mPCa-1212細(xì)胞共培養(yǎng)

mPCa-FCs-1212細(xì)胞為中山醫(yī)院普外科中心實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。當(dāng)細(xì)胞豐度達(dá)到65%～70%時(shí)，用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將純化后的pRNT-U6-siFAP和pRNT-U6-siMOCK分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用含有新霉素1000 μg/ml的培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)胞克隆，并在含新霉素500 μg/ml的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。分別取穩(wěn)定表達(dá)pRNT-U6-siFAP或pRNT-U6-siMOCK的mPCa-FCs-1212細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的mPCa-FCs-1212細(xì)胞作為對(duì)照組，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml。mPCa-1212為中山醫(yī)院普外科中心實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長期癌細(xì)胞，以1∶1的比例分別與上述3組mPCa-FCs-1212共培養(yǎng)3 d。

三、FAP mRNA表達(dá)檢測

收集3組mPCa-FCs-1212細(xì)胞，應(yīng)用Trizol(Invitrogen公司)抽提細(xì)胞總RNA，應(yīng)用ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit[日本東洋紡(TOYOBO)生物科技(上海)有限公司]逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，應(yīng)用SyBR Green RealTime PCR Master MIX[日本東洋紡(TOYOBO)生物科技(上海)有限公司]在熒光定量PCR儀上行實(shí)時(shí)定量PCR。FAP引物為5′-AGGTCTGCAGAGAAGCAAGAATAC-3′和5′-GAATACGAGTGTCAGACA-TGG-3′；內(nèi)參GAPDH引物為5′-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3′和5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′。退火溫度為58℃，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為40次。采用2-△△Ct(△△Ct=△Ct轉(zhuǎn)染組-△Ct對(duì)照組)公式計(jì)算mRNA表達(dá)量。各樣本重復(fù)3次，取均值。

四、FAP蛋白表達(dá)檢測

收集3組mPCa-FCs-1212細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測FAP蛋白表達(dá)。兔抗小鼠FAP抗體及內(nèi)參β-actin抗體(Santa Cruz公司)1∶1000稀釋， AP標(biāo)記的二抗(Jackson Immuno-research公司)1∶1000稀釋，最后ECL發(fā)光。利用BandScan軟件分析各條帶的灰度值，以(FAP 條帶灰度值-背景灰度值)/(β-actin灰度值-背景灰度值)的百分值表示。

五、細(xì)胞增殖抑制檢測

取3組共培養(yǎng)細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)密度接種于96孔培養(yǎng)板各孔，分別培養(yǎng)1～7 d，每組每天設(shè)3個(gè)復(fù)孔。檢測時(shí)每孔加入MTT 20 μl(5 mg/L)培養(yǎng)4 h，離心去上清，加入DMSO溶解沉淀，用酶標(biāo)儀測各孔490 nm處的吸光值(A490)，取均值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值)×100%。

六、細(xì)胞凋亡檢測

取3組共培養(yǎng)3 d的細(xì)胞，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，加入Annexin V-APC結(jié)合液室溫避光孵育10 min，加入碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。以20 000個(gè)細(xì)胞為檢測單位，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、siFAP轉(zhuǎn)染的沉默效果

siFAP組、siMOCK組、對(duì)照組mPCa-FCs-1212細(xì)胞的FAP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.584±0.029、1.052±0.281、1.103±0.325， siFAP組顯著低于siMOCK組及對(duì)照組(P=0.0213、0.0187)，而siMOCK組與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.0732)。

siFAP組、siMOCK組、對(duì)照組mPCa-FCs-1212細(xì)胞的FAP蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(27.18±3.23)%、(61.58±4.72)%、(65.29±4.78)%(圖1)。siFAP組顯著低于siMOCK組和對(duì)照組 (P=0.0317、0.0389)，而siMOCK組與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0912)。

圖1siFAP組(1)、siMOCK組(2)、對(duì)照組(3)細(xì)胞的FAP蛋白表達(dá)

在免疫熒光顯微鏡下觀察， siFAP組的成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中呈現(xiàn)很弱的紅色熒光，而siMOCK組和對(duì)照組的成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)呈現(xiàn)出明顯的紅色熒光(圖2)，與蛋白質(zhì)印跡法檢出的蛋白表達(dá)結(jié)果相吻合。

圖2siFAP組(a)、siMOCK組(b)、對(duì)照組(c)細(xì)胞的FAP蛋白表達(dá)(熒光顯微鏡 ×200)

二、mPCs-1212細(xì)胞增殖抑制率

與siFAP轉(zhuǎn)染的mPCa-FCs-1212細(xì)胞共培養(yǎng)的mPCa-1212細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間的延長而增加，而與siMOCK轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的mPCa-FCs-1212細(xì)胞共培養(yǎng)的mPCa-1212細(xì)胞在培養(yǎng)第2天即進(jìn)入指數(shù)生長期，至第5天開始增殖略變慢(圖3)。siFAP轉(zhuǎn)染的mPCa-FCs-1212細(xì)胞對(duì)mPCa-1212細(xì)胞的增殖抑制率顯著高于siMOCK轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的mPCa-FCs-1212細(xì)胞(P值均<0.01，表1)。

圖3 各組細(xì)胞的增殖抑制率

組別第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天siFAP組2．51±2．7010．01±3．4023．02±3．3232．73±2．4741．23±2．3847．34±1．2747．66±1．61siMOCK組1．01±0．201．21±0．671．11±0．232．05±0．874．73±1．896．79±2．127．11±1．56未轉(zhuǎn)染組0．90±0．301．03±0．811．07±0．431．89±0．763．78±1．795．82±2．116．92±1．89P值-0．00920．00740．99220．00780．00060．0004

注：P值為siFAP組與未轉(zhuǎn)染組比較；-：未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

三、mPCa-1212細(xì)胞凋亡的變化

siFAP、siMOCK轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的mPCa-FCs-1212細(xì)胞分別與mPCa-1212細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后，mPCa-1212細(xì)胞的凋亡率分別為(42.31±5.34)%、(7.38±2.09)%及(7.02±2.09)%。凋亡細(xì)胞主要以早期凋亡為主，偶爾也伴隨少數(shù)的晚期凋亡和壞死細(xì)胞。與siFAP轉(zhuǎn)染的mPCa-FCs-1212細(xì)胞共培養(yǎng)的mPCa-1212細(xì)胞的凋亡率顯著高于與siMOCK轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染mPCa-FCs-1212細(xì)胞共培養(yǎng)的mPCa-1212細(xì)胞(P值均為0.000)。

討 論

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(TAFs)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、生長和轉(zhuǎn)移。FAP則是TAFs表面的一個(gè)增殖性標(biāo)志物，其過度表達(dá)可以促進(jìn)局部上皮細(xì)胞增殖及腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤基質(zhì)成分的50%～95%是由FAP表達(dá)陽性的成纖維細(xì)胞所構(gòu)成，其主要位于血管周圍，可與血液循環(huán)中的抗體結(jié)合。此外FAP是一種僅在局部表達(dá)的膜分子，不能分解為可溶性產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，從而保證腫瘤局部有豐富的靶物質(zhì)[5]。我們以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在注射重組FAP核酸疫苗后，小鼠對(duì)胰腺癌的免疫耐受力明顯高于未免疫小鼠，其對(duì)于小鼠胰腺癌的增殖有一定的抑制效果[6]。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了siFAP的mPCa-FCs-1212細(xì)胞的FAPmRNA及蛋白表達(dá)被明顯抑制，證實(shí)本研究所設(shè)計(jì)的siRNA序列是正確的，同時(shí)也表明，mPCa-FCs-1212細(xì)胞過表達(dá)FAP基因。

mPCa-FCs-1212細(xì)胞的FAP基因被沉默后，可以抑制小鼠胰腺癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)并導(dǎo)致該細(xì)胞發(fā)生凋亡。

由此可見，F(xiàn)AP蛋白的表達(dá)與小鼠胰腺癌細(xì)胞及腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡關(guān)系密切。當(dāng)FAP蛋白呈現(xiàn)穩(wěn)定的高表達(dá)時(shí)，無論是胰腺癌上皮細(xì)胞還是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞都呈現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，且細(xì)胞增殖明顯；而當(dāng)FAP表達(dá)受抑制時(shí)，上述細(xì)胞的增殖和生長狀態(tài)均受到抑制并開始出現(xiàn)凋亡，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長日趨明顯。本研究結(jié)果可為針對(duì)TAFs作為治療目標(biāo)，開展靶向性生物治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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Effectoffibroblastactivationproteinexpressionsilencingofmousefibroblastcellsontheproliferationofmousepancreaticcancercells

SHAOYe-bo,JINDa-yong,RONGYe-fei,XUXue-feng.

DepartmentofGeneralSurgical,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

Correspndingauthor:XUXue-feng,Email:xu.xuefeng@zs-hospital.sh.cn

ObjectiveSmall interfering RNA (siRNA) was used to silence the fibroblast activation protein (FAP) expression of mouse pancreatic cancer related fibroblast cells (mPCa-FCs-1212), and to observe the effects of mPCa-FCs-1212 silencing FAP gene on mouse pancreatic cancer cells (mPCa-1212) proliferation and apoptosis.MethodsThe small interfering RNA targeting FAP gene was designed; the recombinant siRNA plasmid siFAP and control plasmid siMOCK was constructed, which were transfected into mPCa-FCs-1212, respectively. The FAP mRNA and protein expression in transfected cells were examined by real-time PCR and Western blotting. The mPCa-1212 and transfected mPCa-FCs-1212 were co-cultured with a 1∶1 ratio in vitro. The growth inhibitory rates and apoptosis rates of mPCa-1212 were detected by MTT assay and Annexin V-FITC/PI staining and FCM assay.ResultsThe mRNA and protein expressions of FAP in siFAP transfected mPCa-FCs-1212 were significantly down-regulated when compared with that in siMOCK transfected mPCa-FCs-1212[0.584±0.029vs.1.052±0.281,P=0.0213; (27.18±3.23)%vs. (61.58±4.72)%，P=0.0317]. The mPCa-1212 was co-cultured with the mPCa-FCs-1212 transfected with siFAP or siMOCK for 3 d, and the inhibitory rates of mPCa-1212 were (23.02±3.32)% and (1.11±0.23)%, and the apoptosis rates were (42.31±5.34)% and (7.38±2.09)%， the difference between the two groups was statistically significant (P=0.000).ConclusionsmPCa-FCs-1212 silencing FAP gene can inhibit the proliferation of mPCa-1212 in vitro and induce cell apoptosis, and may be a potential new approach to gene therapy.

RNA, small interfering; Gene silence; Fibroblast activation protein; Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.008

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青年基金資助項(xiàng)目(科補(bǔ)-261)

200032 上海，復(fù)旦大學(xué)普外科研究所 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科

許雪峰，Email: xu.xuefeng@zs-hospital.sh.cn

2012-03-07)

(本文編輯：呂芳萍)