郝 念 胡勇平 張惠成 劉小玲 董 映

角膜病是常見的致盲性眼病，絕大部分患者可以通過角膜移植而復明，但由于角膜捐獻數(shù)量非常有限，絕大部分患者因得不到移植角膜而無法復明［1］。近年來，新興的角膜組織工程給眾多的角膜病患者帶來復明的希望。角膜組織工程重建的技術關鍵是形成角膜上皮細胞、基質細胞、內皮細胞和支架載體的三維復合體。故支架載體材料是組織工程學研究的主要內容，也是組織工程構建角膜的必要條件之一［2］。然而選擇合適的材料作為載體支架仍是困擾此項技術開展的難題，至今未有實質性突破［3］。透明質酸(hyaluronic acid，HA)作為一種可吸收降解、相容性良好的生物材料，已廣泛應用于臨床。但透明質酸材料質地柔軟，機械強度差，尚無法作為支架材料運用于組織工程重建。本研究嘗試化學交聯(lián)合成高強度的交聯(lián)透明質酸材料，制備組織工程支架材料置入兔角膜層間，觀察交聯(lián)透明質酸材料的生物相容性，探討其作為角膜組織工程支架材料可行性。

材料與方法

1．實驗動物及分組:雄性新西蘭白兔18只(杭州師范大學實驗動物中心提供)，8周齡，體重2．5～3．0kg，隨機分為兩組，實驗組(n=9):每只兔眼角膜基質層間置入交聯(lián)透明質酸材料;對照組(n=9):僅制作角膜層間囊袋，不置入材料。術前檢查兔眼前節(jié)正常。

2．支架載體材料:(1)交聯(lián)透明質酸的制備:采用藥用級透明質酸100g，4℃加水溶脹過夜，配置成10%透明質酸鈉1000ml溶液待用。按照如下配方配置交聯(lián)反應液A，其組分和重量百分比的含量:BDDE(丁二醇二縮水甘油基醚):30ml，氫氧化鈉溶液0．5mol/L:50ml，加蒸餾水至500m l。將交聯(lián)反應液A加入透明質酸溶液，在40℃，反應6h，即得初步交聯(lián)產物，用蒸餾水反復洗滌4次，再加入二步交聯(lián)液B。二步交聯(lián)液B的組分和重量百分比的含量:DVS(二乙基砜)10m l，碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液 0.8mol/L:50ml，pH=10，加蒸餾水至500ml，繼續(xù)反應4h，用蒸餾水洗滌，再加入0．5g/L的甘氨酸溶液1000ml浸泡2．5h，蒸餾水充分洗滌，干燥后備用。(2)交聯(lián)透明質酸支架材料的制備:將上述制備的交聯(lián)透明質酸材料切割成直徑為5．0mm，高為4．0mm的圓柱體，采用病理切片機將圓柱體切片成厚度為30μm直徑為5．0mm的圓片，將圓片貼附于直徑為5．0mm×5．0mm的載玻片上，用環(huán)氧乙烷滅菌備用。

3．動物實驗過程:所有新西蘭白兔用氯胺酮(50mg/kg)和氯丙嗪(25mg/kg)混合肌內注射麻醉，均以右眼為術眼，1%丁卡因滴眼表面麻醉，消毒鋪巾開瞼器開瞼。用尖刀片于實驗組兔右眼上方角鞏膜緣內側1．5mm透明角膜做一長3.0mm，深約1/2角膜厚度的切口，月形刀伸入切口在角膜基質層內分離出直徑約8．0mm的囊袋。將消毒備用的交聯(lián)透明質酸支架材料置入角膜囊袋內展平，角膜囊袋切口自然復位(圖1A)。對照組兔右眼僅制作角膜板層囊袋，不置入材料。術畢妥布霉素地塞米松眼膏涂眼，術后妥布霉素地塞米松眼水滴眼3次/天，持續(xù)7天。

4．眼部一般情況觀察:術后1周、2周、1個月、2個月、3個月裂隙燈顯微鏡觀察術眼角膜愈合情況，有否角膜支架材料脫出、角膜混濁，包括角膜新生血管、排斥反應等發(fā)生。

5．角膜組織學觀察:分別于術后2周、1個月、3個月處死兩組白兔，即刻摘取術眼固定于中性甲醛液中。角膜組織經常規(guī)固定脫水、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察。各時間點處死的動物:兩組均為3只兔。

6．角膜掃描電鏡觀察:將上述步驟取材的術眼角膜組織經20%戊二醛固定，緩沖液漂洗，鋨酸固定1．5h后乙醇脫水，噴金后進行掃描電鏡觀察。

結 果

1．眼部一般情況:術后1～3天，實驗組及對照組均可見球結膜輕度充血，手術區(qū)域角膜上皮輕度水腫，結膜囊有少許分泌物，所有反應于術后1周內逐漸減輕并消失。觀察期內實驗組及對照組角膜透明，上皮完整，未見角膜新生血管長入，兔眼角膜內交聯(lián)透明質酸植片在裂隙燈下透明狀(圖1B、圖1C)。所有兔眼均未見角膜壞死、角膜潰瘍及置入材料脫出。

圖1 材料置入后的實驗組兔眼

2．角膜組織學觀察:術后2周，在置入材料周圍可見少量的單核細胞以及少量中性白細胞，未見有明顯壞死組織和淋巴細胞浸潤。術后1個月，上述部位未見明顯炎性細胞浸潤，材料置入部位的角膜基質纖維走向與周圍基質相比較紊亂(圖2A)。術后3個月，有1例兔眼可見置入角膜基質部位少量新生血管(圖2B)，周圍的基質膠原染色較深，其余兔眼可見角膜膠原纖維排列整齊，置入部位不能辨認，切口愈合。整個觀察期內未見置入物析出和異物包裹現(xiàn)象。角膜上皮細胞、基質細胞及內皮細胞的排列和形態(tài)均未見明顯改變。對照組術后2周兔角膜可見輕微炎性反應，在其他觀察時間點，角膜內未見炎性細胞，膠原纖維排列整齊，纖維染色未見異常。

圖2 材料置入術后實驗組兔角膜組織切片

3．角膜掃描電鏡觀察:實驗組各個時期的角膜膠原纖維排列較規(guī)則，膠原纖維間未見明顯的析出物，術后3個月發(fā)生角膜新生血管的兔角膜中可見膠原纖維間有潛在間隙，其內有碟形的紅細胞存在(圖3A，3B)，在其兩側角膜基質中膠原纖維排列無明顯變化。

圖3 材料置入術后3個月實驗組兔角膜電鏡照片

討 論

角膜組織工程利用組織工程學技術，將培養(yǎng)的種子細胞種植于合適的載體支架上，體外構建一個近似正常的角膜組織，最終替代病變的角膜組織。1993年Minami等［4］在膠原凝膠中加入培養(yǎng)的角膜基質細胞，而后將牛角膜內皮、上皮細胞分別種植在凝膠的底部和上部繼續(xù)培養(yǎng)，首次體外成功構建三維牛角膜組織，將體外角膜重建變?yōu)楝F(xiàn)實。但上述重建的角膜組織是以膠原凝膠作為支架材料，存在機械強度和韌性不足，透明度低等缺陷無法進一步運用臨床。此后研究人員嘗試選用羊膜、合成膠原、異種脫細胞角膜基質以及人工合成材料等作為角膜組織工程重建的支架材料，但都因為以上生物或合成材料存在各種缺陷，角膜組織工程重構仍停留于實驗研究階段［5～9］。角膜體外重建支架材料不僅要有一般支架材料良好的生物相容性、立體三維結構、生物可降解性、良好的細胞生長界面、可塑性及機械強度這些基本要求，還要能滿足角膜透明屈光、透氧等特殊要求，因此尋求理想的支架材料是角膜組織工程重建亟待解決問題之一［10，11］。

透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種獨特的線性大分子黏多糖，由葡萄糖醛酸和N—乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復交替連接而成。HA廣泛分布于動物和人體結締組織細胞外基質中。它與其他天然黏多糖不同，不與蛋白質共價結合，不存在引發(fā)抗原反應的基團，有良好的生物相容性，體內可生物吸收降解，是一種理想的天然生物材料。目前透明質酸或其衍生物運用于外科手術防粘連、促進傷口愈合、骨關節(jié)炎癥治療以及緩釋藥物載體等方面［12］。眼科方面，透明質酸運用已久，如白內障手術中常用的黏彈劑。此外臨床研究發(fā)現(xiàn)在非穿透性小梁手術中應用透明質酸生物膠能有效抑制青光眼濾過術后瘢痕形成，維持穩(wěn)定眼壓。

雖然透明質酸已廣泛運用臨床，若以透明質酸作為角膜組織工程重建支架材料，由于存在質地柔軟，機械強度差等缺陷，不符合角膜組織工程重建支架材料的要求。本研究采用交聯(lián)改性方法，使透明質酸材料的物理性狀改善，滿足角膜重建支架材料物理強度要求。透明質酸經過二次化學交聯(lián)，生物相容性有否改變，對機體組織細胞有否毒性等情況尚不明確。生物相容性的評價是生物材料進入臨床實驗前必不可少的關鍵環(huán)節(jié)，生物材料必須具備良好的生物相容性才能確保后期臨床應用的安全性。因此我們將交聯(lián)透明質酸材料置入兔角膜層間，用以觀察評價透明質酸交聯(lián)改性后的生物相容性。實驗結果顯示交聯(lián)透明質酸材料置入后耐受良好，無纖維包裹及排出。在各時間點的組織學檢查中均未發(fā)現(xiàn)明顯炎性細胞浸潤，置入物兩側的角膜基質纖維排列無明顯變化，角膜上皮及內皮保持完整，表明此材料有良好的生物相容性。此外通過裂隙燈檢查中可以看到，兔眼角膜在植入交聯(lián)透明質酸材料后保持透明，表明此材料不僅有良好的生物相容性，而且滿足角膜組織工程支架材料需要良好透明屈光特性這一特殊要求。實驗結果顯示，交聯(lián)透明質酸材料具有成為角膜組織工程體外重建支架材料可能，而深入研究如種子細胞與支架材料三維培養(yǎng)，動物移植模型實驗尚在進行之中。

此外，由于交聯(lián)透明質酸具有良好的生物相容性以及透明屈光性，尚有可能成為人工角膜、人工晶體以及視網膜脫離復位手術的眼外加壓材料替代品，在眼科具有廣闊的發(fā)展前景，具有研究開發(fā)價值。

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