李曉錄，趙國慶，高 明

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 麻醉科，吉林 長春130033）

舒芬太尼以其對血流動力學(xué)干擾較輕，起效快，消除半衰期較短.鎮(zhèn)痛效能更強(qiáng)的特點(diǎn)倍受臨床醫(yī)生的青睞，廣泛應(yīng)用于臨床，尤其適用于心血管手術(shù)麻醉?，F(xiàn)已證實(shí)預(yù)處理舒芬太尼可減輕心肌缺血再灌注損傷［1］，對心肌有保護(hù)作用，但其對心肌細(xì)胞凋亡的影響卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以探討舒芬太尼預(yù)處理與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為心臟手術(shù)和心臟病人非心臟手術(shù)圍術(shù)期用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型的制備 健康雄性SD大白鼠40只，體重200－300g。所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前均禁食12h，可自由飲水。大鼠稱重、麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺，于大鼠胸骨左緣第3－4肋間逐層鈍性分離開胸，暴露心臟，剪開心包膜，在左心耳下方1－2mm處以線做套環(huán)，穩(wěn)定15min以備實(shí)驗(yàn)用。收緊結(jié)扎線即形成左冠狀動脈閉塞心肌缺血，松開結(jié)扎線即形成再灌注。心肌缺血成功標(biāo)志為：心電圖ST段明顯抬高并且結(jié)扎線以下心肌組織顏色由正常變蒼白再變暗。

1.2 分組與處理 所有實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。①假手術(shù)組（（S組空白對照），開胸后穿線做套環(huán)，但不結(jié)扎；②單純?nèi)毖俟嘧⒔M（I／R組），結(jié)扎缺血30min，放松結(jié)扎線后行再灌注120 min；③缺血預(yù)處理組（IPC組），采取結(jié)扎左冠狀動脈前給予三次5min缺血、5min再灌注，而后操作重復(fù)I／R組；④預(yù)處理舒芬太尼組（SPC組），于結(jié)扎左冠狀動脈前分別采用微量泵靜脈泵注舒芬太尼（0.5μg／kg）5min、停5min，重復(fù)預(yù)處理3次，以后操作同I／R組。

1.3 指標(biāo)觀察 心肌細(xì)胞凋亡檢測：具體步驟按心肌細(xì)胞凋亡的原位末端標(biāo)記檢測（TUNEL）法說明書進(jìn)行。光鏡下觀察，細(xì)胞核呈棕褐色染色即為TUNEL陽性。凋亡細(xì)胞記數(shù)時(shí)，采用ImagePro Plus 4.5圖象分析軟件，隨機(jī)選取5個無重疊之高倍鏡視野（40X），計(jì)數(shù)其凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)及總細(xì)胞核數(shù)，按公式［凋亡指數(shù)（AI）＝凋亡心肌細(xì)胞核數(shù)／心肌細(xì)胞核總數(shù)X 100%］計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，取其平均值即為心肌細(xì)胞凋亡率。

免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織Bcl－2、Bax蛋白含量：取心尖上1 mm處心肌常規(guī)制備石蠟切片，免疫組織化學(xué)具體步驟按PV二步法說明書進(jìn)行。Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果的觀察：光鏡下，細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色染色的即為陽性，不染色者為陰性。采用ImagePro Plus 4.5圖象分析軟件半定量分析Bcl－2和Bax的表達(dá)量，在校正光密度后每張切片隨機(jī)取5個高倍鏡（40X）下無重疊之視野，測定其陽性反應(yīng)的平均光密度（OD），以平均光密度（OD）代表含量密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。用one－way ANOVA方法進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠缺血再灌注心肌TUNNEL細(xì)胞計(jì)數(shù)各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果分析可見，與S組比較其余三組凋亡指數(shù)明顯增高（P＜0.01），與I／R組比較IPC組和SPC組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠缺血再灌注心肌TUNEL染色結(jié)果各組切片在光鏡下均可見到TUNEL陽性細(xì)胞，其中S組僅呈散在少量分布，而其余三組在心肌缺血／再灌注后則明顯增多，尤以I／R組凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量增多明顯，且成群分布。IPC組和SPC組凋亡心肌細(xì)胞明顯少于I／R組，介于S組與I／R組之間（圖1）。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡變化的比較

2.3 Bcl－2、Bax蛋白免疫組化染色及半定量分析光鏡下可見陽性的Bcl－2蛋白在胞漿內(nèi)呈棕褐色片狀表達(dá)，而Bax蛋白則積聚于胞漿內(nèi)，呈棕黃色染色。與S組相比，其余三組Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá)明顯增多，OD值顯著增高，組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。IPC組和SPC組的Bcl－2蛋白表達(dá)OD值明顯高于I／R組，而Bax蛋白表達(dá)OD值則顯著降低（P＜0.01）。Bcl－2／Bax蛋白表達(dá)的比值，I／R組明顯低于S組 （P＜0.01or P＜0.05），IPC組與SPC組顯著高于I／R組 （P＜0.01）（表1，圖2，3）。

圖1 TUNEL染色結(jié)果 （A：S組 偶見散在的棕色凋亡細(xì)胞；B：I／R組 凋亡細(xì)胞成群分布；C：IPC組 棕色凋亡細(xì)胞明顯減少；D：SPC組 棕色凋亡細(xì)胞散在分布）

圖2 Bcl－2免疫組化（40×）（鏡下可見Bcl－2蛋白表達(dá)呈棕褐色，分布于胞漿。A：S組；B：I／R組；C：IPC組；D：SPC組）

圖3 Bax免疫組化，（40×）（鏡下可見Bax蛋白表達(dá)呈棕黃色，分布于胞漿中。A：S組；B：I／R組；C：IPC組；D：SPC組）

3 討論

心肌缺血／再灌注損傷（MIRI）是一種比較復(fù)雜且廣泛的病理生理過程，缺血的心肌在恢復(fù)其血供的過程中會增加心肌原有的損害，嚴(yán)重影響缺血后心臟功能的恢復(fù)，對圍術(shù)期病人的生活質(zhì)量甚至生命造成巨大的威脅。細(xì)胞凋亡，又稱細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death），近年來研究表明其在誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷的過程中發(fā)揮重要作用［2］，因此如何減少細(xì)胞凋亡就成為擺在我們面前的首要難題。

本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果觀察到S組偶見凋亡細(xì)胞，I／R組出現(xiàn)大量的心肌細(xì)胞凋亡，而IPC和SPC組細(xì)胞凋亡明顯少于I／R組，可見，心肌缺血再灌注損傷有加重心肌細(xì)胞凋亡的作用。通過對4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較，我們不難看出IPC和SPC組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于I／R組，說明缺血預(yù)處理與舒芬太尼預(yù)處理均有相同的心肌保護(hù)作用。雖然IPC組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較SPC組略低，但缺血預(yù)處理本身是一種損傷因素，有其局限性，臨床應(yīng)用價(jià)值較低，因而預(yù)處理舒芬太尼就成為心肌保護(hù)的首選。

細(xì)胞凋亡受多種調(diào)節(jié)基因的控制，在與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因中，Bcl－2家族是重要的抗凋亡基因，在MIRI中起主導(dǎo)地位，其中Bcl－2是最主要的抗凋亡基因，而Bax的作用則正好相反，其表達(dá)則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。兩者的比值決定著細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IPC組與SPC組的Bcl－2蛋白表達(dá)均較I／R組明顯升高，而Bax蛋白表達(dá)則明顯降低，Bcl－2／Bax比率較I／R組明顯上升，再次說明兩種預(yù)處理方法均有抗凋亡作用，均可通過上調(diào)Bcl－2蛋白與下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，以達(dá)到抗凋亡的目的。

阿片類藥物抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，可能是通過激活心肌細(xì)胞δ受體，從而激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)生存素的表達(dá)，從而促進(jìn)Bcl－2表達(dá)和抑制Bax表達(dá)，同時(shí)開放線粒體ATP敏感性鉀通道，從而抑制細(xì)胞凋亡［3］。在阿片類制劑中舒芬太尼的鎮(zhèn)痛效應(yīng)最強(qiáng)，其主要激動μ受體，同時(shí)也激動δ、κ阿片受體，本研究推測舒太尼預(yù)處理可能通過激活心肌δ受體，調(diào)節(jié)Bcl－2與Bax蛋白的表達(dá)發(fā)揮其抗凋亡作用，對心肌的MIRI損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

心肌低灌注、缺血和復(fù)流、再灌注損傷是心臟手術(shù)與心臟病人非心臟手術(shù)圍術(shù)期發(fā)生各種心臟危險(xiǎn)事件的最常見原因。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果我們不難看出，舒芬太尼有較強(qiáng)的心肌保護(hù)作用，在圍術(shù)期預(yù)處理舒芬太尼可預(yù)防心肌缺血，增加心肌對缺血的耐受力，顯著降低各種心臟危險(xiǎn)事件的發(fā)生，提高手術(shù)安全及預(yù)后，有極其廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］張冬梅，侯春麗，常業(yè)恬，等.舒芬太尼預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌梗死范圍及心肌酶的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（15）：2430.

［2］Freude B，Masters TN，Robicsek F.et al.Apoptosis is initiated bymyocardial ischemia and executed during reperfusien［J］.J Mol Cell Cardiol，2000，32（2）：197.

［3］Yao LL，Wang YG，Cai WJ，et al.Survivin mediates the anti—apoptoticeffect of delta—opioid receptor stimulation in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120：895.