鐘 堃，何法霖，王 薇，張 妍，王治國

（北京醫(yī)院，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，北京100730）

今天我們所知的“參考區(qū)間”概念是Graetsbeck和Saris在上世紀(jì)六十年代末建立的，并于1969年在斯堪的納維亞學(xué)會(huì)大會(huì)上提出［1］。20年后，國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）專家組發(fā)表了第一篇關(guān)于參考值理論的正式IFCC文件［2］。30多年前Galen和Gambino就發(fā)表了標(biāo)志性書籍《超越正態(tài)性》，為何在現(xiàn)在這個(gè)循證醫(yī)學(xué)的時(shí)代還討論參考區(qū)間并使用決定界限來描述特征［3］。三個(gè)新生事實(shí)驅(qū)動(dòng)了以上論題的討論：國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)15189：2007［4］對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的要求、體外診斷（IVD）醫(yī)療器械歐洲指令98／97［5］的執(zhí)行以及與指令間接相關(guān)的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會(huì)（JCTLM）的建立。

本文中，除強(qiáng)調(diào)了重要方面的理論升級(jí)之外，還描述了參考區(qū)間領(lǐng)域新的視角和發(fā)展。

1 參考值理論

參考值與實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)共同發(fā)展，而且它們只在特定的情況下才有意義，通常是在生理或病理情況下。在70年代之前，通常使用的術(shù)語是“正常值”，但它會(huì)有多個(gè)易混淆的不同含義：墨菲（Murphy）列出了其中的7種（統(tǒng)計(jì)學(xué)的——高斯分布——最能代表一個(gè)等級(jí)、一個(gè)等級(jí)中最常規(guī)的代表、最適合生存的、沒有危害——在醫(yī)學(xué)中——常規(guī)的、理想的）［6］。因此它可能是主觀并且模糊的，而且暗示所有在范圍以外的個(gè)體都是“不正常的”。由于上述原因IFCC文件介紹了術(shù)語“參考值”。這些數(shù)值常與健康相關(guān)，除此之外它們也能反映一些特殊的生理狀況如懷孕、或者涉及到某些特殊人群如專業(yè)運(yùn)動(dòng)員等。它的基本概念是這個(gè)數(shù)值代表了一個(gè)特定的人群，因此它們依賴于所選擇的受試對(duì)象。首先，需要明確定義參考個(gè)體的遴選準(zhǔn)則；參考個(gè)體代表了參考人群，參考樣本組從參考個(gè)體中選擇，在其上測量參考值。所得數(shù)值將會(huì)假設(shè)為一個(gè)特定分布（也就是參考分布），并且通過適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析并計(jì)算參考界限。按照慣例，這些界限設(shè)定為包括了95%的測量值。用參考界限定義包括它們的參考區(qū)間需注意以下情況：（1）一個(gè)特定被測項(xiàng)目的參考區(qū)間依賴于參考對(duì)象樣本組中的個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間的生物學(xué)變異；因此，所選擇對(duì)象的數(shù)量和他們的亞組組成可能具有相關(guān)的重要性；（2）需要嚴(yán)格地控制分析前方面以保證從總體人群中收集樣本操作的可重復(fù)性；（3）分析方面是十分重要的。測量的標(biāo)準(zhǔn)化允許在不同對(duì)象組獲得的數(shù)據(jù)具有可比性，并且最終與它們獲得方式不同的，以及不同地點(diǎn)和時(shí)間的人群應(yīng)用也具有可比性；（4）計(jì)算參考界限的方法可能顯著地改變所獲得的結(jié)果，例如，如果應(yīng)用不適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)模型或錯(cuò)誤地執(zhí)行離群值的排除。

2 參考對(duì)象的選擇

通常我們會(huì)選擇“健康”的個(gè)體，但健康如何準(zhǔn)確定義和識(shí)別已在多篇評(píng)論［7－9］中進(jìn)行了解釋。世界衛(wèi)生組織（WHO）的定義：“身體上、精神上和社會(huì)適應(yīng)上的完好狀態(tài)，而不是僅僅是沒有疾病和不虛弱”［10］并不能作為現(xiàn)實(shí)的出發(fā)點(diǎn)。1975年的斯堪的納維亞參考值委員會(huì)嘗試排除一系列病理情況來定義個(gè)體的“健康”［11］。但后來發(fā)現(xiàn)這并不實(shí)際［12］，尤其是涉及到年長者。當(dāng)Horn和Pesce［13］查看美國第三次國家健康和營養(yǎng)檢測調(diào)查（NHANESⅢ）時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)只有不超過10%的70－80歲調(diào)查對(duì)象落在“最健康”類別以內(nèi)。

在選擇個(gè)體時(shí)，有必要考慮所有可能影響檢驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果的因素：性別、年齡、環(huán)境、生活方式和種族等。參考區(qū)間的寬度受到三種變異性來源的影響：選擇的參考個(gè)體的個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間的變異，以及測量系統(tǒng)的分析性變異。個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間變異性的影響要緊密結(jié)合在一起。這兩個(gè)來源的變異性的相對(duì)大小能實(shí)質(zhì)上影響參考區(qū)間作為解釋個(gè)體結(jié)果工具的效用。在大多數(shù)情況下參考區(qū)間在評(píng)價(jià)個(gè)體結(jié)果上的效用和發(fā)現(xiàn)異常數(shù)據(jù)上的敏感性是較低的。

3 間接的參考值

使用數(shù)據(jù)挖掘方法發(fā)表的第一篇論文是在上世紀(jì)60年代并且假設(shè)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果是“正常的”?？紤]到結(jié)果的分布頻數(shù)，應(yīng)該使用一些統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件來排除極端值，排除較小頻率的數(shù)據(jù)，也就是典型的“不健康”個(gè)體。但它不滿足參考值理論的基本原理，其是參考人群特點(diǎn)的精確定義。雖然信息技術(shù)提供我們強(qiáng)有力的計(jì)算方法，也不能認(rèn)為數(shù)據(jù)挖掘方法是定義參考區(qū)間的最好方法。

4 分析前方面

參考區(qū)間研究的樣本必須代表臨床實(shí)踐中樣本的采集。但在臨床實(shí)踐中分析前因素通常很難標(biāo)準(zhǔn)化。所以在進(jìn)行參考區(qū)間研究時(shí)，有必要確切的規(guī)定和描述分析前因素，使得其他研究者能夠重復(fù)同樣的步驟（例如采血設(shè)備和個(gè)人的體位）。表1給出了評(píng)價(jià)血液分析項(xiàng)目時(shí)要考慮的最為重要的分析前因素。對(duì)于體液來說可能需要包括不同的因素，而對(duì)于特定的分析物，則需要更多的信息（例如對(duì)于某些激素的情緒化應(yīng)力水平）。

表1 在建立參考值時(shí)應(yīng)該考慮的主要分析前因素

5 分析中的方面

IFCC文件對(duì)這一主題給出了一系列建議，如文件記錄操作程序。然而，當(dāng)規(guī)定的參考區(qū)間僅應(yīng)用于特定實(shí)驗(yàn)室時(shí)，這些建議有效，因?yàn)樗芾斫饽承┓治龇矫娴男薷氖欠駮?huì)改變參考區(qū)間。反之，在提供給其它實(shí)驗(yàn)室“可轉(zhuǎn)換”的參考區(qū)間定義程序時(shí)無效。

6 參考界限的計(jì)算

包括三個(gè)主要問題：（1）統(tǒng)計(jì)學(xué)提供最為有效的方法從樣本人群所得的結(jié)果推斷整體；（2）不同組間（年齡、性別等）的結(jié)果進(jìn)行分組；（3）排除離群值。

6.1 所涉及的統(tǒng)計(jì)方法

Wootton等人在1951年首次將參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用于參考區(qū)間的計(jì)算。但他們不久就意識(shí)到這種統(tǒng)計(jì)學(xué)模型只能應(yīng)用于少數(shù)的情況，并在兩年后他們建議數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以達(dá)到更接近高斯分布。在數(shù)據(jù)分布的形狀沒有進(jìn)行任何初步驗(yàn)證的情況下就將參考區(qū)間定義為均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差是不正確的做法，但卻已沿用至今。

1987年IFCC發(fā)表了關(guān)于使用分位數(shù)定義參考區(qū)間的里程碑似的文章。首先，選擇使用中間95%分布作為參考區(qū)間計(jì)算。其次，IFCC文件建議參考界限要代表著它們的90%置信區(qū)間。再次，文章建議使用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法來計(jì)算參考界限。使用參數(shù)方法可以降低對(duì)象的數(shù)量，但是要求數(shù)據(jù)具有高斯分布?；谠紨?shù)據(jù)的Box和Cox轉(zhuǎn)換，Horn等人建議使用“穩(wěn)健的方法”進(jìn)行替代，即使在數(shù)據(jù)不太理想的情況下依然能夠提供正確結(jié)果。計(jì)算界限的90%置信區(qū)間，可以使用所謂的“bootstrap”方法學(xué)。

6.2 分組準(zhǔn)則

較直觀的方法是基于計(jì)算兩個(gè)亞組均值之間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性來完成的。Sinton等人，建議只要兩個(gè)均數(shù)之間的差異大于從混合分布95%計(jì)算區(qū)間的1／4時(shí)，就應(yīng)該分為兩組。目前最常用的分組方法是Harris和Boyd建議的，后由美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究院（CLSI）文件C28－A2認(rèn)可。他們建議檢驗(yàn)要包括兩步：第一，評(píng)估均值間的差異，第二，比較它們的標(biāo)準(zhǔn)差。

6.3 離群值的檢出

離群值的正確檢出和排除十分重要。直觀檢查法是簡單而有效的檢出離群值的方法。如果檢出一個(gè)離群值卻沒有明顯的原因來排除它（比如對(duì)象的情況、分析性問題、計(jì)算或記錄錯(cuò)誤），有必要應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法來證明。

目前較為常用的統(tǒng)計(jì)方法是由Dixon建議的。它基于D／R的比值，D是離群值與下一個(gè)或前面數(shù)值的差值的絕對(duì)值，R代表觀察值的總體范圍（最大值－最小值），包括離群值。Horn等人建議了一個(gè)更加復(fù)雜的兩步算法，首先使用Box和Cox方法進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，得到高斯分布，然后使用Tukey穩(wěn)健方法識(shí)別離群值。

7 現(xiàn)狀和未來發(fā)展

實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用不同的參考區(qū)間卻沒有實(shí)際的原因。這種常見的情況對(duì)臨床醫(yī)生和患者的危險(xiǎn)性產(chǎn)生了誤導(dǎo)（同樣的分析結(jié)果根據(jù)所用的參考區(qū)間，在一家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為是“正常的”而另一家實(shí)驗(yàn)室是“異常的”）。另外，它阻礙了常規(guī)數(shù)據(jù)庫的建立，如不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的合并?？朔@種情況的替換方法是建立和執(zhí)行“共同的”參考區(qū)間［14，15］。

7.1 共同的參考區(qū)間

如果分析方法是相同的或經(jīng)過正確的標(biāo)準(zhǔn)化后結(jié)果具有可比性，并且人群具有相同的特征或，可以知道特定項(xiàng)目沒有受到種族或環(huán)境的影響，就可以使用共同的參考區(qū)間。在采用之前需要檢查表2中匯總的一些先決條件是否已達(dá)到。

表2 共同的參考區(qū)間建立和使用必須的先決條件

7.2 建立共同的參考區(qū)間

最好的方法是執(zhí)行多中心研究，目前已在西班牙實(shí)行，并且在北歐國家得到了進(jìn)一步的發(fā)展。它要求：（1）根據(jù)年齡、性別、種族、生活方式等分組所要求對(duì)象的數(shù)量來確定參加研究的單位和所要召集個(gè)體的數(shù)量。（2）分析前階段的清楚定義。理想情況下，在臨床實(shí)驗(yàn)室為了再現(xiàn)樣本處理，應(yīng)對(duì)新鮮樣本進(jìn)行分析。（3）使用可溯源到參考測量系統(tǒng)以及實(shí)驗(yàn)室間高度可比的方法。（4）合理的數(shù)據(jù)分析計(jì)算參考界限。在計(jì)算參考界限之前，必須檢出和排除可能的離群值。

7.3 采用共同的參考區(qū)間

為了能夠應(yīng)用共同的參考區(qū)間，臨床實(shí)驗(yàn)室必須驗(yàn)證在區(qū)間產(chǎn)生過程中采用的那些分析前條件、所用分析系統(tǒng)的性能和服務(wù)人群的特征相似。

分析前條件：如果應(yīng)用相同的分析前條件（比如標(biāo)本類型、禁食等），或者證明任何引入的修改沒有顯著的影響。

分析中的方面：（1）對(duì)特定的分析物，所用方法必須產(chǎn)生可溯源至參考測量系統(tǒng)的結(jié)果。（2）所用方法的分析質(zhì)量應(yīng)控制在總誤差的規(guī)定界線內(nèi)。

7.4 實(shí)驗(yàn)室服務(wù)人群的特征

如果已知種族或者生活方式不會(huì)影響到參考區(qū)間，那么就只用驗(yàn)證分析前和分析中的方面。如果已知種族或生活方式可能會(huì)影響到參考區(qū)間，那么建議臨床實(shí)驗(yàn)室采用來自其服務(wù)人群的小樣本組進(jìn)行參考區(qū)間的確認(rèn)。

參考測量系統(tǒng)的發(fā)展和制造商對(duì)溯源性的依從是一個(gè)緩慢的過程。建立穩(wěn)健的參考區(qū)間是費(fèi)時(shí)和費(fèi)力的過程。由于修正參考區(qū)間是一項(xiàng)很費(fèi)力的工作，而且要求對(duì)臨床醫(yī)生和患者進(jìn)行督導(dǎo)，所以臨床實(shí)驗(yàn)室通常不愿獨(dú)立完成。對(duì)于一些分析項(xiàng)目，正確地定義共同的參考區(qū)間需要較大范圍的多中心研究。為了在這個(gè)領(lǐng)域取得真正的進(jìn)步，需要在完善的理論和并不完備的實(shí)際之間建立起橋梁。

8 采用已確認(rèn)的參考區(qū)間

如果滿足了所有之前規(guī)定的組織上、分析前的和分析中的要求，不僅多中心實(shí)驗(yàn)研究所得的參考區(qū)間可以作為共同的參考區(qū)間，甚至可由單個(gè)實(shí)驗(yàn)室規(guī)定。IFCC參考區(qū)間和決定限委員會(huì)（C－RIDL）最近發(fā)表的一篇文章中顯示，當(dāng)采用單個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立的已確認(rèn)的參考區(qū)間時(shí)，當(dāng)?shù)厝巳簠^(qū)間的初步驗(yàn)證會(huì)有重要的意義。

9 參考區(qū)間與決定限

表3中給出了這兩個(gè)概念的相關(guān)信息。參考區(qū)間描述明確定義了（通常是明顯健康的）人群的生物特征，決定限依賴于診斷性和特殊臨床研究，為的是規(guī)定存在某種疾病或?qū)Σ煌Y(jié)果的概率。選擇的決定限通常是基于兩個(gè)人群（疾?。羌膊。┲丿B的水平以及期望的臨床靈敏度和特異度的程度。

表3 參考區(qū)間和決定界限間的差別

10 個(gè)體的參考區(qū)間

Harris在30多年前就對(duì)個(gè)體的參考區(qū)間給出了理論基礎(chǔ)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，但是在未來的執(zhí)行仍具有挑戰(zhàn)性。信息技術(shù)的發(fā)展允許我們存儲(chǔ)大量資料并對(duì)進(jìn)行快速的檢索和處理。而且溯源性和檢測標(biāo)準(zhǔn)化的改進(jìn)也將會(huì)增加不同地點(diǎn)和時(shí)間結(jié)果的穩(wěn)定性和可比性。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头浅：唵?，要求在穩(wěn)定的健康狀態(tài)時(shí)期從同一個(gè)體采集多份樣本。對(duì)于給定分析物，這些樣本的測量結(jié)果將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)時(shí)間系列，組成一個(gè)基線來判斷未來的結(jié)果。

11 結(jié)論

修改已存在的參考區(qū)間通常是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)，應(yīng)告知臨床醫(yī)生和他們的患者。共同參考區(qū)間的確定將顯著地降低同一項(xiàng)目不同參考區(qū)間的數(shù)量，提供更恰當(dāng)和更有效的信息。實(shí)驗(yàn)室人員需要在這些領(lǐng)域克服實(shí)際困難，盡快將理論改進(jìn)應(yīng)用于臨床實(shí)踐，以使醫(yī)療機(jī)構(gòu)和患者獲得預(yù)期的效益。

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