李明新，于忠和，范晉楠

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤內(nèi)科診治中心，北京100700;2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，太原030001)

人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth fact or receptor 2，Her-2)是一種酪氨酸激酶受體，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員。Park等［1］研究證實(shí)Her-2是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。目前檢測(cè)Her-2/neu的最常用的方法有免疫組織化學(xué)法和熒光原位雜交，這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)，但也都存在很多不足，因此探尋新的檢測(cè)方法成為必然。本試驗(yàn)收集免疫組織化學(xué)方法對(duì)胃癌組織Her-2情況進(jìn)行檢測(cè)的病例資料，探討它們?cè)谖赴┙M織中表達(dá)的相關(guān)性，并用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的方法對(duì)其蠟塊組織進(jìn)行Her-2檢測(cè)，希望能為胃癌組織中Her-2檢測(cè)提供新的方法和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009～2011年北京軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科、普外科、山西腫瘤醫(yī)院行免疫組織化學(xué)檢測(cè)其Her-2蛋白表達(dá)情況的71例經(jīng)病理確診胃癌的組織蠟塊病理數(shù)據(jù)。所有患者術(shù)前均未行化療、放療和免疫治療，其中腺癌70例(包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌)，鱗癌1例。潰瘍型37例，非潰瘍型34例;患者年齡范圍30～80歲，平均年齡58.5歲;其中男55例，女16例。根據(jù)WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，中低分化胃癌37例，高分化34例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例;漿膜浸潤(rùn)31例，未浸潤(rùn)漿膜40例。賁門部胃癌28例，胃竇部胃癌15例，胃體部胃癌28例。TNM分期:Ⅰ/Ⅱ期 46例，Ⅲ/Ⅳ期25例。

1.2 試劑和儀器 試劑:QIAGEN(QIAanp DAN FFPE Tissue)試劑盒、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京雅康博生物科技有限公司。儀器:NanoDrop微量紫外分光光度計(jì)、Heraeus臺(tái)式高速離心機(jī)、生物安全柜、電熱恒溫水槽、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光PCR儀器(Agilent Technol-ogies Stratagene Mx3000P)等。

1.3 方法

1.3.1 收集資料 病案室查找病例，統(tǒng)計(jì)胃癌患者的病理數(shù)據(jù)。

1.3.2 提取DNA 自行分離石蠟包埋組織中的腫瘤組織，DNA提取按照試劑盒QIAGEN(QIAanp DAN FFPE Tissue)說(shuō)明書進(jìn)行。自提取的DNA樣本中，吸取1 μL樣本置于分光光度計(jì)小孔上，自動(dòng)檢測(cè)樣本中DNA濃度。將提取的DNA置于－20℃冰箱保存。

1.3.3 RT-PCR反應(yīng) 將提取的DNA樣本稀釋到20～50 ng/μL，按實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書用8聯(lián)管進(jìn)行加樣，輕彈混勻后短暫離心，放置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng):預(yù)變性95℃，10 min，1個(gè)循環(huán);95℃，15 s和60℃，1 min，40個(gè)循環(huán)，在退火階段進(jìn)行熒光采集。

1.3.4 結(jié)果判讀 根據(jù)熒光定量PCR儀的使用說(shuō)明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。如果陰性對(duì)照品不呈典型的S型曲線或無(wú)Ct值，陽(yáng)性對(duì)照品呈典型的S型曲線且5＜Ct值＜35，待檢DNA樣品在內(nèi)參及Her-2檢測(cè)試劑檢測(cè)中呈典型的S型曲線且5＜Ct值＜35，則可繼續(xù)分析。待檢DNA樣品中Her-2基因相對(duì)基因拷貝數(shù)(X)由目的基因和參照基因的Ct值的差異計(jì)算出來(lái)。計(jì)算公式為:X=K×2－ddCt(K校正系數(shù))，待檢樣品在內(nèi)參、Her-2檢測(cè)試劑中擴(kuò)增的Ct值分別記為Ct1、Ct2，陽(yáng)性對(duì)照品在內(nèi)參、Her-2檢測(cè)試劑中擴(kuò)增的Ct值分別記為Ct3、Ct4。ddCt=(Ct2－Ct1)－(Ct4－Ct3)。當(dāng) X＞4.5時(shí)，判斷為 Her-2基因擴(kuò)增陽(yáng)性;當(dāng)X＜2時(shí)，判斷為Her-2基因擴(kuò)增陰性;當(dāng)2＜X＜4.5時(shí)，判斷為不確定，可通過熒光原位雜交進(jìn)行確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有研究資料和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。結(jié)果分析進(jìn)行Pearsonχ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法 胃癌組織中Her-2的過表達(dá)率為22.5%，Her-2的過表達(dá)與胃癌的部位、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有顯著的相關(guān)性(P＜0.05)，與年齡、性別、分化程度、大體分型、浸潤(rùn)深度無(wú)顯著相關(guān)性(P ＞0.05)(表1)。

表1 胃癌組織中Her-2的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.2 配對(duì)設(shè)計(jì)的71例組織蠟塊Her-2表達(dá)狀態(tài)，免疫組織化學(xué)法Her-2過表達(dá)者16例(22.5%)，實(shí)時(shí)熒光PCR法Her-2過表達(dá)者14例(19.7%)，陽(yáng)性一致率為76.5%(13/17)，陰性一致率為 93.1%(54/58)，總一致率為94.4%(67/71)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異(P ＞0.05)(表2)。

表2 免疫組化與實(shí)時(shí)熒光PCR兩種檢測(cè)方法的比較

3 討論

Her-2基因定位于第17號(hào)染色體的17q21，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的一個(gè)成員，編碼具有酪氨酸激酶活性的一種185×103的跨膜糖蛋白?？蓮亩鄠€(gè)途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物活動(dòng)，如腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、轉(zhuǎn)移和分化等相關(guān)基因的調(diào)控。Her-2作為乳腺癌患者重要的預(yù)后指標(biāo)、對(duì)化療治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子及曲妥珠單抗靶向治療的靶點(diǎn)已被醫(yī)學(xué)界所證實(shí)［2］。2009年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)會(huì)議上報(bào)道的一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照的國(guó)際Ⅲ期臨床研究To-GA試驗(yàn)［3］，為晚期胃癌的靶向治療掀開了新的篇章，并確定了Her-2檢查在胃癌臨床診治中的地位，Her-2對(duì)胃癌有預(yù)測(cè)價(jià)值;同時(shí)也奠定了曲妥珠單抗在胃癌治療中的地位?；谠搶?shí)驗(yàn)結(jié)果，赫賽汀擴(kuò)大了其適應(yīng)證，2010年1月，在歐洲赫賽汀用于治療Her-2陽(yáng)性的晚期胃癌的申請(qǐng)已獲得了批準(zhǔn)。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中Her-2的過表達(dá)率為22.5%，Her-2的過表達(dá)與胃癌的部位、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有顯著的相關(guān)性(r值分別為0.294、0.41、0.354，P ＜0.05)，其中賁門部過表達(dá)率最高(35.7%)，胃竇次之 (26.7%)，胃體最低(7.1%)，與 ToGA 試驗(yàn)［3］結(jié)果相似:胃癌組織 Her-2陽(yáng)性率中國(guó)大陸為23%，并受腫瘤部位、病理類型和標(biāo)本類型等多種因素影響，胃食管連接部位癌Her-2陽(yáng)性率比胃癌高，分別為33.2%和20.9%(P ＜0.01)。而楊吉利等［4］的研究也表明Her-2的過表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期密切相關(guān)。郭建波［5］的研究Her-2蛋白在胃癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為22.4%(15/67)，而在癌旁正常組織無(wú)表達(dá)，Her-2表達(dá)與患者的性別、年齡、分化程度均無(wú)相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.118、0.020、0.088，P ＞ 0.05)，而與腫瘤的 Lauren分類、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(r值分別為0.294、0.31、0.296，P ＜0.05)。

目前檢測(cè)Her-2最常用的方法是免疫組化，進(jìn)一步是熒光原位雜交。免疫組織化學(xué)技術(shù)因具有簡(jiǎn)便、廉價(jià)，是目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)HER-2狀態(tài)的主要方法。但該技術(shù)受組織固定、處理、抗體批次及觀察者主觀性等的影響，結(jié)果差異性很大，敏感性和特異性差，使Her-2檢測(cè)結(jié)果存在著一定的不確定性。熒光原位雜交法結(jié)果判讀準(zhǔn)確，敏感性和特異性高，但實(shí)驗(yàn)過程較復(fù)雜，相對(duì)耗時(shí)，費(fèi)用較昂貴，失敗率偏高。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)用定量熒光PCR法對(duì)樣本進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)兩種方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性一致率為76.5%(13/17)，陰性一致率為 93.1%(54/58)，總一致率為94.4%(67/71)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異(χ2=0.25，P ＞ 0.05)。Barberis 等［6］在乳腺癌的研究也表明兩種方法有高度的一致性(82%)，而且在所有美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的檢測(cè)中PCR技術(shù)具有成本-效益優(yōu)勢(shì)。Bossard等［7］在乳腺癌中的研究中兩種方法一致率為84%，PCR是檢測(cè)Her-2表達(dá)狀態(tài)的備選方法。Tse等［8］的研究中參考于免疫組織化學(xué)法，PCR的靈敏度為87.5%，特異度為100%;而參考于熒光原位雜交，PCR的靈敏度為89.5%，特異度為92%。Nistor等［9］的研究表明，PCR和熒光原位雜交的一致率為92%。同時(shí)還有很多實(shí)時(shí)PCR能對(duì)乳腺癌石蠟組織中Her-2的擴(kuò)增及表達(dá)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的報(bào)道［10-11］。而且實(shí)時(shí)熒光PCR法1次試驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)46個(gè)標(biāo)本，能滿足大醫(yī)院臨床檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室的需要。鑒于兩種方法的結(jié)果不完全一致可能是在實(shí)驗(yàn)過程中受標(biāo)本采集、處理及觀察者主觀性等的影響引起，在這些方面，定量熒光PCR顯然更具優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR具有簡(jiǎn)便、客觀、高效、可重復(fù)性高等特點(diǎn)，其檢測(cè)結(jié)果與免疫組化和熒光原位雜交的結(jié)果有很高的一致性，且具有明顯的成本-效益優(yōu)勢(shì)，可望成為胃癌組織中除免疫組化和熒光原位雜交外檢測(cè)Her-2表達(dá)狀態(tài)的一種備選方法。

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