郝靖惠，楊 博，白慶霞，張 艷，劉曉靜，陸 群

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032)

牙本質(zhì)－牙髓復(fù)合體可適應(yīng)各種刺激引發(fā)的防御反應(yīng)，保存活力，而且其主要作用是分泌牙本質(zhì)基質(zhì)。牙齒發(fā)育完成后，牙髓仍通過內(nèi)環(huán)境和自我保護(hù)機(jī)制起營養(yǎng)牙本質(zhì)的作用，還能重新刺激牙本質(zhì)生成來抵御外界傷害。牙髓的損傷修復(fù)取決于其受損程度，對于溫和的刺激，修復(fù)涉及一個(gè)簡單的成牙本質(zhì)細(xì)胞生成牙本質(zhì)活動(dòng)的上調(diào)過程，即反應(yīng)性牙本質(zhì)生成過程;如遇到強(qiáng)烈的組織損傷，就會(huì)發(fā)生更復(fù)雜的防御修復(fù)反應(yīng)，需要干/祖細(xì)胞的募集，分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，并上調(diào)牙本質(zhì)基質(zhì)的分泌活動(dòng)，即修復(fù)性牙本質(zhì)的生成過程。雖然在此過程中所涉及的分子也參與發(fā)育過程，但其和發(fā)育不同的是沒有牙源性上皮與間充質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)過程。對成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)機(jī)制研究是將干細(xì)胞向臨床治療轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。

Gronthos等(2000)首先提出成人牙髓中存在具備自我更新和多向分化潛能的前體細(xì)胞—牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)，并證明其具有形成牙本質(zhì)－牙髓樣復(fù)合體的能力，認(rèn)為牙髓干細(xì)胞在牙本質(zhì)－牙髓的損傷修復(fù)中具有非常重要的作用［1］。目前，關(guān)于牙髓損傷修復(fù)的研究僅局限于牙齒本身，當(dāng)牙髓損傷時(shí)，牙髓干細(xì)胞可分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，在損傷部位形成修復(fù)性牙本質(zhì)而修復(fù)缺損，保護(hù)牙髓組織。然而，牙源性干細(xì)胞來源匱乏且擴(kuò)增困難，而且牙齒是人體的器官之一，亦應(yīng)考慮到其損傷后參與修復(fù)的全身性因素，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其具有自我更新及多向分化潛能，并在骨、軟骨、心臟、神經(jīng)、皮膚等損傷中發(fā)揮重要作用［2－6］。當(dāng)牙髓損傷時(shí)，機(jī)體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否參與修復(fù)及其在修復(fù)中的作用尚未見報(bào)道。因此尋找非牙源性的間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化參與牙本質(zhì)缺損的修復(fù)就顯得尤為重要。本研究利用GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質(zhì)缺損模型探討B(tài)MMSCs是否參與牙髓損傷的修復(fù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

GFP轉(zhuǎn)基因大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心提供);流式細(xì)胞儀(ELITEESP型，Beckman－Couher，美國);倒置熒光顯微鏡和照相系統(tǒng)(Olympus，日本);α－MEM 培養(yǎng)液(Gibco公司，美國);胎牛血清(Hyclone公司，美國);胰蛋白酶、Hoechst 33342(Sigma公司，美國);綠色熒光蛋白(GFP)多克隆抗體(Abcam，美國);FITC熒光二抗(Chemicon，美國)。

1.2 方法

1.2.1 GFP轉(zhuǎn)基因大鼠 BMMSCs的培養(yǎng)

取3周齡GFP轉(zhuǎn)基因大鼠2只，脫頸處死后750 mL/L乙醇浸泡10 min，無菌超凈臺(tái)內(nèi)完整分離股骨、脛骨，剔凈軟組織，剪去骨骺端，5 mL一次性注射器吸取α－MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，沖出骨髓并轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打成全骨髓細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min，棄去上清，α－MEM 培養(yǎng)液重懸，接種至75 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48 h后首次換液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，胰酶消化傳代。

1.2.2 GFP－BMMSCs嵌合 SD 大鼠模型的構(gòu)建和構(gòu)建后檢測方法

取8周齡SD大鼠10只，隨機(jī)抽取2只用于正常對照，其余8只用60Co－γ射線全身照射進(jìn)行預(yù)處理，照射劑量為6 Gy。在照射完畢12 h后，24 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射SD大鼠裂紅全骨髓細(xì)胞懸液與GFP大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的混合液(1×108裂紅全骨髓細(xì)胞+2×106GFP大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)0.5 mL。

細(xì)胞移植后30 d，分別取嵌合大鼠及正常組大鼠外周血，經(jīng)紅細(xì)胞裂解后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，檢測其單核細(xì)胞中熒光細(xì)胞的比例然后脫頸處死所有大鼠，取其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)約5 d，待細(xì)胞匯合達(dá)60%時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中熒光細(xì)胞所占的比例;同時(shí)取嵌合大鼠心臟、肝臟、腎臟，即刻送冰凍切片，Hoechest 33342襯染10 min，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3 GFP－BMMSCs嵌合 SD 大鼠牙本質(zhì)缺損模型的構(gòu)建及HE和免疫熒光染色觀察

同上法制備9只GFP－BMMSCs嵌合大鼠，30 d后待移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全嵌合，用10 g/L戊巴比妥鈉液(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定。750 mL/L乙醇棉球擦拭消毒左側(cè)上頜磨牙區(qū)，用高速渦輪機(jī)和球鉆在左側(cè)上頜第一磨牙牙合面制造牙本質(zhì)缺損，右側(cè)上頜第一磨牙不做任何處理用于對照，每個(gè)牙合面缺損深度均控制在0.5～1 mm，且未見穿髓點(diǎn)。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，分別于術(shù)后5、10、15 d各處死3只大鼠，即刻分離上頜骨，40 g/L多聚甲醛固定24 h，170 g/L EDTA脫鈣30 d，流水沖洗24 h后沿上頜第一磨牙矢狀方向制作5 μm冰凍切片和常規(guī)石蠟切片，分別進(jìn)行免疫熒光和HE染色，熒光顯微鏡和顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果

2.1 GFP－BMMSCs嵌合大鼠模型的檢測指標(biāo)

2.1.1 嵌合大鼠外周血單核細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中熒光細(xì)胞的比例

GFP－BMMSCs嵌合大鼠模型構(gòu)建后30 d，外周血單核細(xì)胞中熒光細(xì)胞比例為7.9%(圖1b)，而正常大鼠僅為0.3%(圖1a)，嵌合大鼠BMMSCs中熒光細(xì)胞的比例為33.4%(圖1d)，而正常大鼠僅為0.7%(圖1c)。

2.1.2 GFP－BMMSCs嵌合大鼠各臟器中熒光細(xì)胞的分布

嵌合大鼠心臟(圖2a～b)、肝臟(圖2c～d)、腎臟(圖2e～f)中均發(fā)現(xiàn)有少量綠色熒光細(xì)胞，且出現(xiàn)在毛細(xì)血管周圍。

2.2 GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質(zhì)缺損牙齒HE染色

正常對照組(圖3a)，牙髓組織由成牙本質(zhì)細(xì)胞層、多細(xì)胞層和固有牙髓細(xì)胞構(gòu)成，成牙本質(zhì)細(xì)胞成柱狀排列在髓腔內(nèi)壁。缺損5 d組(圖3b)，牙髓組織成牙本質(zhì)細(xì)胞層部分壞死，牙髓小血管擴(kuò)張，炎癥明顯，缺損部位所對應(yīng)的髓腔內(nèi)壁出現(xiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)。缺損10 d組(圖3c)，缺損對應(yīng)的髓壁處出現(xiàn)大量狹長形態(tài)的細(xì)胞層，髓室內(nèi)小血管增生。缺損15 d組(圖3d)，牙髓炎癥明顯減輕，缺損部位所對應(yīng)的髓腔內(nèi)壁出現(xiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)。

2.3 GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質(zhì)缺損牙齒免疫熒光染色

正常對照組(圖4a，b)髓腔內(nèi)存在少量表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞。缺損5 d組(圖4c，d)，髓腔內(nèi)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量增加。缺損10 d組(圖4e，f)，髓腔內(nèi)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)增加，并分布在缺損所對應(yīng)的髓壁。缺損15 d組(圖4g，h)，髓腔內(nèi)綠色熒光細(xì)胞數(shù)量較10 d組減少。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

圖2 冰凍切片結(jié)果(×200)

圖3 HE染色結(jié)果

圖4 免疫熒光染色結(jié)果(×40)

3 討論

牙髓與牙本質(zhì)在胚胎發(fā)生上聯(lián)系密切，對外界刺激有互聯(lián)效應(yīng)，當(dāng)牙本質(zhì)缺損時(shí)，外界刺激必然會(huì)通過牙本質(zhì)小管引起牙髓反應(yīng)。當(dāng)牙齒受到酸蝕、磨耗等進(jìn)展緩慢的刺激，牙本質(zhì)缺損程度較小時(shí)，成牙本質(zhì)細(xì)胞合成分泌活動(dòng)上調(diào)，分泌基質(zhì)進(jìn)而礦化形成反應(yīng)性牙本質(zhì);而當(dāng)牙齒受到牙折、深齲等強(qiáng)烈且進(jìn)展快速的刺激，牙本質(zhì)缺損程度較大時(shí)，會(huì)激發(fā)牙髓產(chǎn)生生物保護(hù)性反應(yīng)為主的炎癥反應(yīng)，牙髓組織中有分化潛能的干細(xì)胞或前體細(xì)胞會(huì)分化為新的成牙本質(zhì)細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)并礦化形成修復(fù)性牙本質(zhì)［7］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的一種多能成體干細(xì)胞，能夠自我更新，并具有多向分化的潛能［2］，被認(rèn)為是組織工程中的重要種子細(xì)胞。Mikako等研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)皮膚缺損［6］;Beeres等利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功修復(fù)心肌損傷［8］;于金華等已觀察到BMMSCs具有形成牙本質(zhì)－牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的能力［9］。以上研究均為干細(xì)胞修復(fù)組織缺損方面積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，也使得研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對牙本質(zhì)牙髓損傷進(jìn)行修復(fù)成為牙齒損傷修復(fù)新的研究方向。綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因大鼠為干細(xì)胞示蹤提供了良好的動(dòng)物來源，本課題組前期研究已經(jīng)證明了GFP－BMMSCs體外擴(kuò)增后持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，并具有多向分化性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了良好的示蹤干細(xì)胞［10］。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液的誘導(dǎo)下，可分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞［11］。

以往利用GFP嵌合模型的研究中，有學(xué)者成功的觀察到GFP標(biāo)記的骨髓細(xì)胞遷移到骨折損傷部位、腦梗塞損傷區(qū)以及腎炎損傷區(qū)［3，12－13］。本研究于細(xì)胞移植后30 d通過流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP嵌合模型大鼠外周血單核細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中熒光細(xì)胞的比例以及心臟、肝臟、腎臟等組織冰凍切片觀察到熒光細(xì)胞的分布，證實(shí)了通過尾靜脈注射的GFP－BMMSCs已嵌合至SD大鼠體內(nèi)，且大部分細(xì)胞歸巢到骨髓。本實(shí)驗(yàn)首次使用GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠模型研究 BMMSCs在牙髓損傷修復(fù)中的作用，觀察到在未造牙本質(zhì)缺損的對照組，也有少量的熒光細(xì)胞的分布，這可能是由于60Co射線的照射對大鼠各組織器官造成一定的損傷，而與此相比，在牙本質(zhì)缺損組，有更多的GFP－BMMSCs可遷移到損傷的牙髓部位，上述結(jié)果表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與牙髓牙本質(zhì)修復(fù)密切相關(guān)，因此，可考慮通過增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的遷移分化能力來發(fā)展干細(xì)胞在牙髓損傷中的治療。

本研究還發(fā)現(xiàn)在牙本質(zhì)缺損15 d組，牙髓充血消失，牙髓組織已基本恢復(fù)正常，而熒光細(xì)胞的數(shù)量有所減少，推測可能是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)損傷后又歸巢到骨髓或者逐漸凋亡，目前，關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在修復(fù)損傷后的去向問題尚無報(bào)道，還有待于進(jìn)一步研究。

在目前已有的研究中，關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對組織損傷修復(fù)的機(jī)制有兩種不同的觀點(diǎn):有學(xué)者認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是通過分化為損傷部位的細(xì)胞而參與修復(fù)的［3，6］;另有學(xué)者則認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是遷移到損傷部位通過分泌組織修復(fù)相關(guān)因子調(diào)節(jié)組織損傷處的炎癥而參與損傷的修復(fù)［15］。有鑒于此，我們將繼續(xù)利用 GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質(zhì)缺損模型來研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)牙髓損傷的具體機(jī)制。

已有研究證明:wnt信號通路在牙齒發(fā)育過程中起著重要作用。我們前期的體外研究也發(fā)現(xiàn):經(jīng)典wnt通路可能負(fù)向調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的分化。據(jù)此提出假說:當(dāng)牙本質(zhì)缺損程度較重，致牙髓損傷時(shí)，能否通過抑制wnt通路來增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)牙本質(zhì)－牙髓損傷的修復(fù)。故還將繼續(xù)利用GFP－BMMSCs嵌合大鼠牙本質(zhì)缺損模型研究wnt通路對機(jī)體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移以及在牙髓損傷修復(fù)中的作用，以期通過調(diào)節(jié)經(jīng)典wnt通路來促進(jìn)牙本質(zhì)－牙髓損傷的修復(fù)，為將來臨床治療較嚴(yán)重的牙本質(zhì)缺損提供新的治療策略。

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