鈔亞鵬，楊 敬，黃 兵，黃 英，錢世鈞

（中國科學院微生物研究所 傳感技術(shù)國家聯(lián)合重點實驗室

微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京 100101）

回轉(zhuǎn)條件下微生物產(chǎn)酶表征

鈔亞鵬，楊 敬，黃 兵，黃 英，錢世鈞

（中國科學院微生物研究所 傳感技術(shù)國家聯(lián)合重點實驗室

微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京 100101）

選定3株高產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的細菌（枯草芽孢桿菌）、放線菌（鏈霉菌）和絲狀真菌（里氏木霉）作為模式菌株，研究了在回轉(zhuǎn)條件下單獨發(fā)酵產(chǎn)酶及混合培養(yǎng)產(chǎn)酶過程及能力。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和里氏木霉在p H值6.0～7.9之間都可生長。在回轉(zhuǎn)條件下發(fā)酵30 d，枯草芽孢桿菌維持一定產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力；鏈霉菌能夠產(chǎn)少量的蛋白酶和淀粉酶；里氏木霉除了具有一定的產(chǎn)纖維素酶能力外，也能產(chǎn)少量的蛋白酶和淀粉酶。將3株菌進行分步混合培養(yǎng)，發(fā)酵過程中均能保持較高的淀粉酶活力和蛋白酶活力，在20 d和30 d的發(fā)酵液中檢測不到纖維素酶活力。

回轉(zhuǎn)條件；微生物；淀粉酶；蛋白酶；纖維素酶

隨著我國載人航天事業(yè)的發(fā)展，深入開展受控生態(tài)生命保障系統(tǒng)（CELSS）研究，以實現(xiàn)封閉環(huán)境下的物質(zhì)供給、廢物處理和循環(huán)使用，已成為該領(lǐng)域面臨的重要課題［1］。建立未來CELSS的重要條件之一是實現(xiàn)其中有機廢物的降解和循環(huán)使用。在CELSS中，植物、動物的生命活動會產(chǎn)生大量的有機廢棄物，而淀粉、蛋白、纖維素是這些有機廢棄物的主要成分。在處理這些廢棄物的過程中，利用特定微生物進行高效降解并實現(xiàn)循環(huán)利用具有條件溫和、功能多樣的優(yōu)點［2］。

目前對于微重力條件下單一微生物的形態(tài)、生理性狀報道較多［3～5］，尚未見對微生物混合培養(yǎng)的報道。根據(jù)CELSS對微生物處理廢棄物的潛在需求，本研究選用實驗室已有的3株高效產(chǎn)酶的模式菌株：產(chǎn)中性蛋白酶的細菌枯草芽孢桿菌As 1398（同時具有較高淀粉酶活性）、具有較高降解特殊蛋白能力的放線菌鏈霉菌AS 4.412［6］、產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌里氏木霉Trichoderma reeseiRUT C30（TR）［7］，分析其在模擬微重力效應(yīng)的簡單回轉(zhuǎn)條件下單獨及混合產(chǎn)酶的特征，擬為CELSS中復(fù)雜有機廢物的高效處理篩選和研制降解能力較強、作用效果持久的酶類，進而為設(shè)計適用于太空微重力環(huán)境下微生物酶深度處理有機廢棄物的生物反應(yīng)器和運行工藝提供參考。

1 實驗

1.1 菌株

枯草芽孢桿菌As 1398，鏈霉菌AS 4.412，里氏木霉Trichoderma reeseiRUT C30（TR）。

1.2 儀器和回轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件

SM－Z1型單軸回轉(zhuǎn)儀，中國科學院空間科學與應(yīng)用研究中心。

回轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件：回轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速10 r·min－1，回轉(zhuǎn)半徑0.10 m。

1.3 培養(yǎng)基

蛋白酶培養(yǎng)基：可溶性淀粉5 g，K2HPO40.5 g，酪蛋白4 g，純水定容到1 L，p H值8.0。

淀粉酶培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，酵母粉5 g，蛋白胨1.5 g，純水定容到1 L，p H值自然。

纖維素酶培養(yǎng)基：微晶纖維素33 g，玉米漿27 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀6 g，硫酸鎂1 g，甘油2.5 m L，吐溫－80 2 m L，純水定容到1 L，p H值4.5。

固體培養(yǎng)基：于上述液體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂。用硫酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)p H值，制備不同p H值梯度平板。

混合培養(yǎng)基：上述各產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配方加倍，純水定容到1 L，p H 值7.0。

如無特殊說明，后續(xù)實驗中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌用淀粉酶培養(yǎng)基，鏈霉菌用蛋白酶培養(yǎng)基，里氏木霉用纖維素酶培養(yǎng)基。

1.4 方法

1.4.1 細胞／孢子種子液制備

枯草芽孢桿菌種子液制備：從生長24 h的牛肉汁斜面挑取1環(huán)菌苔，接入液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)12 h，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)后，稀釋成106～107個·m L－1懸液。

鏈霉菌種子液制備：從生長6 d的高氏1號斜面用接種鏟摳下一塊菌苔，按10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)72 h。

里氏木霉種子液制備：從生長7 d的PDA平板刮取孢子于無菌水中，渦旋振蕩2 min，二層無菌濾紙過濾除去碎片，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)后，稀釋成106～107個·m L－1懸液。

1.4.2 回轉(zhuǎn)條件下平板培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌、鏈霉菌、里氏木霉細胞／孢子種子液分別在淀粉酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基平板上點樣1.5μL，每平板4個點；待種子液晾干后將一個平板固定在回轉(zhuǎn)儀上，另一相同平板于地面1 g重力對照條件下靜置培養(yǎng)，其它條件均相同，培養(yǎng)溫度均為28℃。觀察菌落形態(tài)和水解圈大小。

再將3株菌分別在p H值為6.0、6.5、7.0、7.5、7.9的梯度平板上培養(yǎng)，分別于3 d、6 d觀察生長情況。

1.4.3 菌株單獨液體發(fā)酵的回轉(zhuǎn)培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：枯草芽孢桿菌在淀粉酶液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h制備種子；鏈霉菌在蛋白酶液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d制備種子；里氏木霉在纖維素酶液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h制備種子。

在50 m L的螺口離心管中分別加入20 m L淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶液體培養(yǎng)基，接種2 m L相應(yīng)的種子培養(yǎng)物。每組做3個平行，一組于回轉(zhuǎn)條件下培養(yǎng)，一組于1 g重力對照條件下靜置培養(yǎng)。分別于4 d、8 d、20 d、30 d取樣分析淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶活力，實驗數(shù)據(jù)為3管樣品的平均值。

1.4.4 菌株混合發(fā)酵的回轉(zhuǎn)培養(yǎng)

將1 m L里氏木霉種子接種于10 m L纖維素酶液體培養(yǎng)基中，分別在回轉(zhuǎn)條件和1 g重力對照條件下培養(yǎng)，每組做3個平行。在第5 d、10 d、15 d的培養(yǎng)物中，加入等體積的混合培養(yǎng)基，并接入As 1398種子0.1 m L和AS 4.412種子2 m L。在同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并于第20 d、第30 d取樣，測定3種酶活力，同時鏡檢3株菌在發(fā)酵液中的存活情況。

1.4.5 菌株存活情況的分析

取第30 d的單菌／混合培養(yǎng)樣品200μL，分別涂布于LB和PDA平板上。于28℃培養(yǎng)3～7 d，觀察生長情況。

1.4.6 分析與檢測

1.4.6.1 蛋白酶活力測定

采用 Folin－Ciocalteu 法測定，略 有改動［6］。取1 m L適當稀釋的酶液，加入到1.5 m L 1% 酪蛋白（用50 mmol·L－1Tris－HCl溶解）懸液中，置于40℃水浴中保溫15 min，在反應(yīng)液中加入3 m L 10% 三氯乙酸終止反應(yīng)，室溫靜置30 min。然后于8000 r·min－1離心10 min，取1 mL上清液于干凈的管子中，向其中加入5 mL 0.55 mol·L－1Na2CO3溶液，再加入1 mL Folin－Ciocalteu試劑，將混合液置于40℃水浴中保溫15 min。在680 nm波長下測吸光度。酶和底物保溫之前加入三氯乙酸作為對照，其它操作不變。

1個蛋白酶活力單位定義為：和對照相比，每分鐘使吸光度增加10%所需的酶量。

1.4.6.2 淀粉酶活力測定

參照文獻［8］進行。取0.4 m L 0.2%可溶性淀粉（菱糊牌）40℃預(yù)熱15 min，加入0.1 m L適當稀釋的酶液，在加酶液之前加入1.5 m L 0.1 mol·L－1HCl作為對照，40℃保溫10 min，樣品管加入1.5 m L HCl終止反應(yīng)。樣品管和對照管分別加入3 m L 1 mol·L－1I2－KI液及5 m L H2O，搖勻，在700 nm波長下測定吸光度。

1個淀粉酶活力單位定義為：和對照相比，每分鐘使吸光度減少10%所需的酶量。

1.4.6.3 纖維素酶活力測定

按照輕工部的標準進行測定［9］。在試樣管中加入1 m L緩沖溶液和1張濾紙條于50℃水浴中平衡3 min，加入0.5 m L酶液，保溫1 h，加入3 m L DNS試劑，混合，沸水浴中煮10 min，自來水冷卻。加蒸餾水10 m L，混合，在540 nm波長下測吸光度。對照管不加酶液保溫1 h，加入3 m L DNS試劑后再加酶液，其它與樣品管相同。

1個纖維素濾紙酶活力（FPAU）單位定義為：每分鐘催化產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量。

1.4.6.4 蛋白含量測定

采用Bradford方法進行［10］。將100μL發(fā)酵液加入到2.5 m L CBB中，以不加發(fā)酵液的CBB為對照，595 nm波長比色，OD值除以0.99即為蛋白含量，單位 mg·m L－1。

2 結(jié)果與討論

2.1 平板培養(yǎng)

3株菌在淀粉酶培養(yǎng)基平板、蛋白酶培養(yǎng)基平板、纖維素酶培養(yǎng)基平板上的生長形態(tài)和產(chǎn)酶情況見圖1、表1。

圖1 3株菌在平板上的生長形態(tài)和產(chǎn)酶情況Fig.1 Morphology and enzyme production of three strains on agar plates

由圖1可知，枯草芽孢桿菌As 1398能夠較好地在淀粉酶培養(yǎng)基平板和蛋白酶培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生水解圈，在纖維素酶培養(yǎng)基平板上也能夠生長。鏈霉菌AS 4.412在淀粉酶培養(yǎng)基和蛋白酶培養(yǎng)基平板上也有明顯的水解圈產(chǎn)生，但不能在纖維素酶培養(yǎng)基平板上生長。里氏木霉TR在淀粉酶培養(yǎng)基平板、蛋白酶培養(yǎng)基平板及纖維素酶培養(yǎng)基平板上都能生長，且形成暈狀圈。

表1 3株菌在平板上的生長情況Tab.1 The growth of three strains on agar plates

由表1可知，回轉(zhuǎn)條件下，As 1398的菌落直徑略小于地面1 g重力對照條件；AS 4.412的情況正好相反；而TR在培養(yǎng)第4 d時回轉(zhuǎn)條件下生長稍微快一些，8 d后看不出差異。

實驗發(fā)現(xiàn)，3株菌均能在p H值6.0～7.9的平板上生長，但 AS 4.412在p H 值6.0、6.5的平板上生長較緩慢，3 d時未見生長，其余平板上3 d時3株菌都已明顯生長，6 d時3株菌在p H值6.0～7.9的平板上均生長良好。

2.2 單菌發(fā)酵產(chǎn)酶特征

3株菌在液體培養(yǎng)條件下的單菌發(fā)酵產(chǎn)酶特征見表2。

表2 單菌發(fā)酵產(chǎn)酶特征Tab.2 Enzyme production of single culture of each strain

由表2可知，枯草芽孢桿菌As 1398在回轉(zhuǎn)條件下的淀粉酶活力、蛋白酶活力都較高，第4 d時分別為6.84 U·m L－1和5.88 U·m L－1；但是和對照條件相比，回轉(zhuǎn)條件下30 d時的酶活力要低得多。鏈霉菌AS 4.412在回轉(zhuǎn)和對照條件下的淀粉酶活力、蛋白酶活力均較低。雖然如此，由于該菌能夠產(chǎn)生一定量的蛋白酶，所以在較難降解蛋白廢棄物的處理中仍會有用處。里氏木霉TR在回轉(zhuǎn)條件下維持較低的纖維素酶活力，同時也維持一定的淀粉酶活力和蛋白酶活力。

總之，在兩種培養(yǎng)條件下，As 1398和TR均比較穩(wěn)定地具有三種（或其中的兩種）酶活，搭配使用可以滿足對可能的淀粉、蛋白、纖維素類有機廢棄物的分解。考慮到人類活動中會產(chǎn)生少量的角蛋白類廢物，鏈霉菌AS 4.412的產(chǎn)一定量蛋白酶的能力，使其具有用于降解有機廢物中少量角質(zhì)類蛋白的潛力。

2.3 分步混合發(fā)酵產(chǎn)酶特征（表3）

表3 混合發(fā)酵產(chǎn)酶特征Tab.3 Enzyme production of mixed culture of three strains

由表3可知，不管是對照條件還是回轉(zhuǎn)條件下，淀粉酶都維持了較高的活力水平；蛋白酶也有較為穩(wěn)定的持續(xù)表達。說明在混合培養(yǎng)體系中，如果有淀粉類和蛋白類的廢棄物，微生物產(chǎn)生的酶將具備持續(xù)的降解能力。

纖維素酶的情況比較特殊，在混合體系中20 d和30 d時都沒有檢測到明顯的酶活力。對比單菌培養(yǎng)中里氏木霉TR的產(chǎn)酶特點，可能性之一是細菌和放線菌的蛋白酶將纖維素酶水解了，導(dǎo)致纖維素酶活力喪失。為驗證這一可能性，取發(fā)酵好的纖維素酶液和蛋白酶液按1∶1混合，于28℃放置4.5 h，測定纖維素酶活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中蛋白酶對纖維素酶本身沒有顯著的降解作用。另一種可能性是3株菌之間存在拮抗作用，以及在培養(yǎng)保溫過程中原有酶活力緩慢喪失所致。通過平板對峙實驗，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對里氏木霉有顯著的拮抗能力（結(jié)果未顯示），這可能導(dǎo)致混合發(fā)酵過程中出現(xiàn)比較復(fù)雜的產(chǎn)酶情況，故先單獨培養(yǎng)里氏木霉有利于廢棄物中纖維素的降解。

2.4 回轉(zhuǎn)發(fā)酵后菌株的存活分析

發(fā)酵液的平板培養(yǎng)檢查表明，單菌培養(yǎng)30 d后各株菌都有生長，說明3種菌單菌回轉(zhuǎn)發(fā)酵后都可以較好存活；混合培養(yǎng)30 d后，平板檢測發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌大量生長，基本未見真菌生長，可能原因是真菌受到枯草芽孢桿菌拮抗而無法生長，而放線菌生長緩慢，可能也受到了細菌的抑制。

2.5 討論

根據(jù)文獻報道，微生物在微重力條件下某些酶產(chǎn)量出現(xiàn)提高的現(xiàn)象，如淀粉酶、纖維素酶均有效價提高的報道，但都僅限于純培養(yǎng)菌株的產(chǎn)酶特征。本實驗不但檢測了回轉(zhuǎn)條件下純培養(yǎng)的產(chǎn)酶特征，同時檢測了混合培養(yǎng)下的產(chǎn)酶特征。盡管本實驗是在地面上利用回轉(zhuǎn)器粗略研究微生物產(chǎn)酶特征，但從實驗結(jié)果來看，不同菌株的產(chǎn)酶特征并不一致，有提高也有降低；同種酶在純培養(yǎng)條件下的效價與混合培養(yǎng)條件下的效價也存在差別。這表明微生物的產(chǎn)酶特征與培養(yǎng)條件緊密相關(guān)，回轉(zhuǎn)條件使微生物的產(chǎn)酶特征出現(xiàn)一定變化。

對地面回轉(zhuǎn)單一因素的產(chǎn)酶特征研究表明，某些微生物的酶產(chǎn)量及混合培養(yǎng)的酶總量高于地面1 g重力對照，這在一定程度上說明在模擬微重力條件下用微生物酶及混合培養(yǎng)總酶處理的應(yīng)用前景較好，預(yù)示著產(chǎn)降解酶的微生物菌株在太空微重力條件下具有潛在的應(yīng)用價值。另外，針對不同性狀的有機廢物需采用不同的處理策略：（1）對于主要生活廢棄物，其主要殘余有機物為淀粉、蛋白等成分，可以直接用細菌和放線菌處理；（2）對于含有少量纖維素但同時含有大量淀粉、蛋白類的廢棄物，可采用先用真菌處理，再用細菌和放線菌處理；（3）對于木質(zhì)纖維素類廢棄物（如農(nóng)業(yè)廢棄物），可主要采用真菌處理。

3 結(jié)論

（1）3株菌在回轉(zhuǎn)條件下的產(chǎn)酶特點：細菌枯草芽孢桿菌As 1398具有較高產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力；放線菌鏈霉菌AS 4.412能夠產(chǎn)少量的蛋白酶和淀粉酶；絲狀真菌里氏木霉TR除了具有一定的產(chǎn)纖維素酶能力外，也能產(chǎn)生一定量的蛋白酶和淀粉酶。

（2）混合培養(yǎng)發(fā)酵液中幾乎檢測不到纖維素酶活力，而能夠長時間維持較高的淀粉酶活力和蛋白酶活力?？梢姳緦嶒灄l件下混合培養(yǎng)對木霉的生長和產(chǎn)纖維素酶不利。

在未來的太空CELSS應(yīng)用環(huán)境下，由于同時存在微重力及宇宙輻射等多種空間因素，菌株的產(chǎn)酶特征與地面模擬微重力及地面正常重力條件下可能還有差異，菌株的產(chǎn)酶可能還會受到其它因素的影響，這有待利用未來太空搭載試驗和我國載人空間站科學實驗平臺進行深入研究。

［1］ 郭雙生，尚傳勛.國外生命保障系統(tǒng)的概念研究進展［J］.航天醫(yī)學與醫(yī)學工程，1995，8（1）：75－77.

［2］ Williams D W，Kull R，Schwartzkopf S H.Anaerobic treatment of organic wastes from controlled ecological life support system［A］.SAE Technical Paper Series No.921272，22nd International Conference on Environmental Systems，Seattle，WA，1992.

［3］ 王偉，薛小平，楊慧，等.模擬微重力環(huán)境對大腸桿菌形態(tài)與表面超微結(jié)構(gòu)的影響研究［J］.化學與生物工程，2011，28（2）：14－17.

［4］ 劉桂蘭，劉寧，阮繼生，等.模擬微重力對鏈霉菌生長和代謝的影響［A］.中國空間科學學會第七次學術(shù)年會會議手冊及論文集［C］，2009.

［5］ Rosenzweig Jason A，Abogunde Ohunene，Thomas Kayama，et al.Space flight and modeled microgravity effects on microbial growth and virulence［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，85（4）：885－891.

［6］ Xie F H，Chao Y P，Yang X Q，et al.Purification and characterization of four keratinases produced byStreptomycessp.strain 16 in native human foot skin medium［J］.Bioresource Technology，2010，101（1）：344－350.

［7］ Wu G H，He R L，Jia W D，et al.Strain improvement and process optimization ofTrichoderma reeseiRUT C30 for enhanced cellulase production［J］.Biofuels，2011，2（5）：545－555.

［8］ 淡家林，徐純錫，任永娥.軟腐芽孢桿菌D20產(chǎn)CGTase的條件和酶性質(zhì)［J］.微生物學報，1988，28（2）：136－142.

［9］ 鐘鍵，楊敬，鈔亞鵬，等.高效酶解中性汽爆玉米秸稈的工藝優(yōu)化［J］.化工學報，2011，62（10）：2867－2876.

［10］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quatitation of microgram quatities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72（1）：248－254.

Enzymatic Characteristics of Microbial Fermentation Under Clinostat Rotation

CHAO Ya－peng，YANG Jing，HUANG Bing，HUANG Ying，QIAN Shi－jun
（State Key Laboratory of Transducer Technology，State Key Laboratory of Microbial Resources，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing100101，China）

Bacillus subtilis，StreptomyceteandTrichoderma reeseiwere selected for production of amylase，proteinase（keratinase）and cellulase under clinostat rotation.It was found that the three strains could grow on plates with in the p H range from 6.0 to 7.9.Bacillus subtilisandStreptomycetemaintained low level of amylase and proteinase，respectively.Trichoderma reeseicould produce all three kinds of enzymes.When mixing the three microbes together as a co－culture，both amylase and proteinase were produced at a high level during 20 d or 30 d under clinostat rotation，while no cellulase was detected.The above results provided possible strategies for the degradation of organic wastes from the life system in the future CELSS.

clinostat rotation；microorganism；amylase；proteinase；cellulase

Q 93

A

1672－5425（2012）11－0013－05

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.004

中國科學院知識創(chuàng)新工程項目（KJCX2－YW－L08）

2012－08－15

鈔亞鵬（1974－），男，山西臨縣人，博士，副研究員，主要從事工業(yè)酶制劑開發(fā)應(yīng)用和酶工程研究；通訊作者：黃英，博士，研究員，E－mail：huangy＠im.ac.cn。