樂(lè) 薇

（武漢長(zhǎng)江工商學(xué)院工學(xué)院，湖北 武漢 430065）

聚酰胺樹(shù)脂提取血竭龍血素

樂(lè) 薇

（武漢長(zhǎng)江工商學(xué)院工學(xué)院，湖北 武漢 430065）

研究了聚酰胺樹(shù)脂對(duì)血竭中龍血素A和龍血素B的提取效果。采用HPLC進(jìn)行定量分析，考察了上樣方法、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速、樹(shù)脂使用次數(shù)等因素對(duì)提取效果的影響，并確定了適宜的梯度洗脫方式。結(jié)果表明，將血竭樣品用乙酸乙酯溶解后，與聚酰胺樹(shù)脂混合，然后將溶劑蒸發(fā)完全進(jìn)行吸附，樹(shù)脂的吸附量為1 g·（g樹(shù)脂）－1。在0.8 m L·min－1洗脫流速下，7 BV的50%乙醇可梯度洗脫被聚酰胺樹(shù)脂吸附的龍血素A和龍血素B，解吸率均達(dá)91%以上，聚酰胺樹(shù)脂使用3次后即需再生。該工藝收率高、操作簡(jiǎn)便，適于血竭龍血素的提取。

聚酰胺樹(shù)脂；提取；血竭；龍血素

血竭是名貴中草藥，廣泛應(yīng)用于膏、丸、丹、散、片及霧劑等中成藥產(chǎn)品中。隨著血竭資源的不斷開(kāi)發(fā)及其成分分析、藥理作用、毒性試驗(yàn)等方面研究的深入，血竭的臨床應(yīng)用前景非常樂(lè)觀［1～3］。龍血素A和龍血素B是血竭中的重要指標(biāo)成分，屬于黃酮類化合物［4，5］。聚酰胺是分離黃酮類化合物較常用的吸附劑［6，7］，黃酮分子中富含的酚羥基與聚酰胺分子中的酰胺基因雙方質(zhì)子共享形成氫鍵而產(chǎn)生吸附，從而與不能形成氫鍵的組分分離，達(dá)到提純的目的。作者利用聚酰胺樹(shù)脂提取血竭中的龍血素，探討了相關(guān)因素對(duì)提取效果的影響，并確定了適宜的洗脫方式。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑及儀器

血竭，云南云河藥業(yè)有限公司。龍血素A、龍血素B對(duì)照品，廣西中醫(yī)藥研究所。

乙酸乙酯，分析純，天津津東天正精細(xì)化工試劑廠；無(wú)水乙醇，分析純，上海振興化工一廠；乙腈，色譜純，上海陸都化學(xué)試劑廠。柱層析用聚酰胺（30～60目），上海第一化學(xué)試劑有限公司。

2537A型紫外分析儀，上海科藝光學(xué)儀器廠；L－7000型高效液相色譜儀，日本日立；Agilent C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱，北京先明樂(lè)施科技發(fā)展有限公司；Lambda35型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，PE公司；RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海安亭電子儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 吸附方法的選擇

參照文獻(xiàn)［8］對(duì)聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理。再向其中加入用乙酸乙酯溶解的血竭樣品原液，于80℃水浴中蒸發(fā)溶劑，并不時(shí)加以攪拌，直至溶劑蒸發(fā)完全。

分別考察不同血竭樣品與聚酰胺樹(shù)脂的質(zhì)量比、吸附時(shí)間的吸附效果。

1.2.2 洗脫條件的選擇

在一定流速下，用乙醇對(duì)已吸附血竭樣品的聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行解吸，計(jì)算龍血素A／B的解吸率及洗脫劑的用量。

1.2.3 龍血素A／B的 HPLC測(cè)定

（1）色譜條件

流動(dòng)相為乙腈－1%冰醋酸（34∶66，體積比）；流速1.0 m L·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；靈敏度0.02 UFS；柱溫40℃。上述色譜條件下，龍血素A的保留時(shí)間為29 min，龍血素B的保留時(shí)間為32 min，二者分離度為1.7。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將龍血素A對(duì)照品儲(chǔ)備溶液分別配制成濃度（μg·m L－1）為4.9、9.8、14.7、19.6、25.5、29.4的對(duì)照品溶液，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾器（0.45μm）濾過(guò)，在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖，進(jìn)樣濃度（c）與峰面積（A）的回歸方程為：A＝612682.1c＋764068.5，相關(guān)系數(shù)R＝0.9996；線性范圍為6.3～127μg·m L－1。

將龍血素B對(duì)照品儲(chǔ)備溶液分別配制成濃度（μg·m L－1）為2.16、4.32、6.48、10.80、12.90的對(duì)照品溶液，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾器（0.45μm）濾過(guò)，在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖，進(jìn)樣濃度（c）與峰面積（A）的回歸方程為：A＝542225.4c＋1760149；相關(guān)系數(shù)R＝0.9993；線性范圍為8.55～171μg·m L－1。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附方法的選擇

由于在聚酰胺樹(shù)脂上稀堿的洗脫能力強(qiáng)于乙醇，所以不能采用氫氧化鈉溶解血竭樣品上柱的方法。但改變上柱液的p H值至酸性范圍，血竭樣品原液幾乎不溶解，也不能被聚酰胺吸附，因此必須采用其它上柱方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將血竭樣品用有機(jī)溶劑溶解后，與聚酰胺混合，然后將溶劑蒸發(fā)完全，可實(shí)現(xiàn)血竭樣品的吸附。

2.2 吸附條件的選擇

2.2.1 血竭樣品與聚酰胺樹(shù)脂的質(zhì)量比

在一定量的聚酰胺樹(shù)脂中加入不同質(zhì)量的血竭樣品原液（乙酸乙酯溶解），考察吸附效果，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 聚酰胺樹(shù)脂對(duì)血竭樣品的吸附效果Tab.1 Adsorption of dragon′s blood（dissolved in EtOAc）by polyamide resin

由表1可知，當(dāng)血竭樣品與聚酰胺樹(shù)脂的質(zhì)量比為1∶1時(shí)，聚酰胺即可達(dá)到吸附飽和，故選擇血竭樣品與聚酰胺的質(zhì)量比為1∶1。

2.2.2 吸附時(shí)間

吸附時(shí)間亦即溶劑蒸發(fā)完全的時(shí)間。將3.5 g血竭樣品用3 m L乙酸乙酯溶解后，與3.5 g聚酰胺樹(shù)脂混合，置于80℃水浴中，每隔10 min觀察一次溶劑蒸發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)30 min即可將溶劑蒸發(fā)完全。

2.3 洗脫條件的選擇

2.3.1 洗脫劑

洗脫劑的選用是影響吸附樹(shù)脂使用效果的重要環(huán)節(jié)，優(yōu)選洗脫劑能提高產(chǎn)物的質(zhì)量和吸附樹(shù)脂的使用效率。要求吸附質(zhì)與洗脫劑的親和力大于吸附質(zhì)和吸附劑的親和力，同時(shí)還要求洗脫劑有較低的沸點(diǎn)、易于蒸餾回收，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇作洗脫劑效果較好。

2.3.2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)

用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)已吸附血竭樣品的聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行解吸，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫血竭龍血素的影響Tab.2 The effect of volume fraction of ethanol on desorption of loureirin in dragon′s blood

由表2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)（如30%），龍血素A、龍血素B不能解吸；50%乙醇作洗脫劑時(shí)，龍血素A、龍血素B解吸率均達(dá)到91%以上；繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，龍血素A、龍血素B的解吸率反而下降。這可能是由于，乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，其它的黃酮類化合物比龍血素A、龍血素B更易解吸，從而使龍血素A和龍血素B的解吸率下降。因此，選用50%的乙醇作洗脫劑。

2.3.3 洗脫流速

流速是柱層析分離的一個(gè)重要指標(biāo)，流速過(guò)快會(huì)縮短分離時(shí)間，同時(shí)也使洗脫劑耗費(fèi)更多；流速過(guò)慢雖然可以提高分離效果，但延長(zhǎng)了分離時(shí)間。在不同流速下，用50%乙醇對(duì)已吸附飽和的聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行解吸，當(dāng)流出液中未檢測(cè)到龍血素時(shí)即認(rèn)為洗脫完全，結(jié)果如圖1所示。

圖1 洗脫流速對(duì)聚酰胺樹(shù)脂洗脫情況的影響Fig.1 The effect of eluting velocity on the desorption for polyamide resin

由圖1可知，隨著洗脫流速的加快，洗脫液體積增大，洗脫時(shí)間縮短；洗脫流速為0.8 m L·min－1時(shí)所需洗脫液體積稍大于洗脫流速0.5 m L·min－1時(shí)的洗脫液體積，但前者比后者解吸時(shí)間短，所以選擇適宜的洗脫流速為0.8 m L·min－1。

2.3.4 梯度洗脫

聚酰胺樹(shù)脂對(duì)不同黃酮類化合物的親和作用有差異，對(duì)飽和吸附血竭的聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、90%。對(duì)各梯度洗脫部分所得干燥物進(jìn)行HPLC分析，其色譜圖見(jiàn)圖2（a～c）（90%乙醇洗脫物在檢測(cè)條件下無(wú)色譜峰，未列出），圖2d是血竭全粉的HPLC色譜圖。

圖2 梯度洗脫物（a～c）和血竭全粉（d）的HPLC色譜Fig.2 The HPLC chromatograms of gradient eluate（a～c）and dragon′s blood powder（d）

進(jìn)一步計(jì)算出各部分龍血素A和龍血素B的含 量，結(jié)果列于表3。

表3 聚酰胺樹(shù)脂的梯度洗脫結(jié)果Tab.3 The results of gradient elution for polyamide resin

由表3可知，50%的乙醇能將絕大部分的龍血素A和龍血素B洗脫下來(lái)，洗脫率均在91%以上。

2.4 樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)的考察

在上述確定的吸附、洗脫條件下，考察聚酰胺樹(shù)脂使用次數(shù)對(duì)血竭中龍血素吸附和解吸的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 聚酰胺樹(shù)脂使用次數(shù)對(duì)血竭龍血素吸附和解吸的影響Tab.4 The effect of frequency of use of polyamide resin on adsorption and desorption of loureirin in dragon′s blood

由表4可知，隨著吸附次數(shù)的增多，聚酰胺樹(shù)脂對(duì)血竭龍血素的吸附量呈下降趨勢(shì)，尤其是使用3次以上時(shí)更為明顯。這是因?yàn)?，乙酸乙酯提取物中含?0%乙醇無(wú)法洗脫的難洗脫物，它們被吸附在聚酰胺樹(shù)脂表面，隨著吸附次數(shù)的增加，難洗脫物在樹(shù)脂上累積，降低了樹(shù)脂的有效吸附容量。同時(shí)，隨著吸附次數(shù)的增加，聚酰胺樹(shù)脂對(duì)血竭龍血素的解吸量也有所下降，其原因可能是樹(shù)脂上的難洗脫物對(duì)血竭龍血素也有一定的吸附作用。因此，重復(fù)使用3次后應(yīng)對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行再生。

3 結(jié)論

將血竭樣品用乙酸乙酯溶解后，與聚酰胺樹(shù)脂混合，然后將溶劑蒸發(fā)完全進(jìn)行吸附，血竭中龍血素的吸附量為1 g·（g樹(shù)脂）－1。在0.8 m L·min－1的洗脫流速下，7 BV的50%乙醇可梯度洗脫被聚酰胺樹(shù)脂吸附的龍血素A和龍血素B，解吸率均高于91%。該工藝收率高，操作簡(jiǎn)便，適用于血竭龍血素的提取。

［1］ 付梅紅，方婧，王祝舉，等.血竭藥理研究與臨床應(yīng)用概述［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（6）：200－202.

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［3］ 樊蘭蘭，屠鵬飛，何鑒星，等.中藥龍血竭原植物劍葉龍血樹(shù)的形態(tài)組織學(xué)研究及所含樹(shù)脂的分布和成分檢測(cè)［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33（10）：1112－1117.

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［7］ 黃松，丁婕，陶艷，等.聚酰胺樹(shù)脂精制甜茶總黃酮的工藝研究［J］.中國(guó)新藥與臨床藥理，2010，21（3）：311－315.

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Abstraction of Loureirin A and B in Dragon′s Blood by Polyamide Resin

YUE Wei
（Engineering Institute of Wuhan Yangtze Business University，Wuhan430065，China）

The abstraction of loureirin A and B in dragon′s blood by polyamide resin was studied.The effect of sampling method，eluent volume fraction，eluting velocity，frequency of use of polyamide resin on the abstraction efficiency were investigated，and the quantitative analysis was conducted on HPLC.And the gradient elution way was optimized.Results showed that，the adsorbing capacity of polyamide was 1 g·g－1resin when the process was as follows：after dissolved with acetic ether，the sample was mixed with polyamide resin，and then the organic solvent was evaporated completely.The loureirin A and B adsorbed by polyamide resin could be gradiently eluted more than 91%by 7 BV of 50%ethanol at the eluting velocity of 0.8 m L·min－1.The process was fit for the abstraction of loureirin A and loureirin B in dragon′s blood with high yield and simple operation.

polyamide resin；abstraction；dragon′s blood；loureirin

TQ 460.6

A

1672－5425（2012）11－0057－04

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.016

2012－07－16

樂(lè)薇（1979－），女，湖北沙市人，碩士，講師，研究方向：生物分析，E－mail：yuewei11＠126.com。