廉少杰，張偉國

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

梯度溫度法提高L-賴氨酸發(fā)酵水平的研究

廉少杰，張偉國*

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

對黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)XQ90發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的條件進行了研究。結(jié)果表明:兩階段溫度控制策略(0～18h 31℃，18h～結(jié)束34℃)更有利于提高產(chǎn)量和發(fā)酵強度;在控溫的基礎(chǔ)上發(fā)酵周期縮短至60h;同時通過連續(xù)流加葡萄糖和硫酸銨確定了最佳殘?zhí)蔷S持濃度5～10g/L和最佳氨氮濃度1.0～2.0g/L;在最優(yōu)條件下，賴氨酸鹽酸鹽的產(chǎn)量從111g/L提高到151g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達50.2%。

黃色短桿菌，溫度控制，流加發(fā)酵，殘?zhí)?，氨?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)XQ90 江南大學生物工程學院代謝調(diào)控與代謝工程研究室保藏菌種;完全培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖5、牛肉膏10、蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、瓊脂20;種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖25、(NH4)2SO42、KH2PO420、MgSO4· 7H2O 0.4、玉米漿35、碳酸鈣40;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖80、(NH4)2SO48、KH2PO420、MgSO4.7H2O 0.8、MnSO4·4H2O 0.02、FeSO4·7H2O 0.02、VB110、VH50、玉米漿10、糖蜜12;以上培養(yǎng)基均以20% NaOH調(diào)pH至7.8，完全培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基121℃滅菌20min，發(fā)酵培養(yǎng)基115℃滅菌10min。

SBA－40C生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;立式圓形壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器有限公司;往復(fù)式搖床 無錫查橋輕機廠; UV－2100可見紫外分光光度計 上海尤尼克有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;PHS－3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠;5L發(fā)酵罐 高百特發(fā)酵機(上海)有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 500mL三角瓶中裝液量80mL，置于往復(fù)式搖床上90r/min，31℃振蕩培養(yǎng)16h。

1.2.2 5L發(fā)酵罐發(fā)酵 發(fā)酵罐中裝液量2L，流加濃氨水控制pH7.0～7.2，通過流加泡敵消泡，發(fā)酵過程中流加800g/L的糖溶液和500g/L的(NH4)2SO4，控制發(fā)酵罐體積2.5L左右，中間過程進行連續(xù)放料，進多少、排多少。

1.3 分析方法

1.3.1 pH測定 國產(chǎn)精密pH試紙和PHS－3C型精密pH計測定。

1.3.2 OD的測定 取發(fā)酵液稀釋25倍后，在波長562nm下測量吸光度。

1.3.3 發(fā)酵液中還原糖、L－賴氨酸的測定 采用SBA－40C生物傳感分析儀測定;氨氮的測定采用微量凱氏定氮裝置。

1.3.4 菌體干重(DCW)的測定 取發(fā)酵液10mL于5000r/min離心分離10min，并用蒸餾水洗滌兩次，然后置于105℃條件下干燥至恒重，從而得到菌體干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對L－賴氨酸發(fā)酵的影響

微生物的生長和產(chǎn)物的合成均需在其各自適合的溫度下進行。溫度對微生物的生長、產(chǎn)物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，而且會影響細胞代謝過程中各種關(guān)鍵酶的活性。溫度對發(fā)酵的影響是各種因素綜合變現(xiàn)的結(jié)果，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境［5］。

從圖1、圖2可以看出，隨著溫度的升高賴氨酸產(chǎn)生菌進入生長穩(wěn)定期的時間縮短，穩(wěn)定期最大菌體量與最大比生長速率均出現(xiàn)在31℃時，故此溫度是該菌株的最適生長溫度。隨著溫度升高賴氨酸的合成速率在逐漸增加，但當超過34℃時，產(chǎn)物合成速率和產(chǎn)量明顯降低，最大比生長速率降低，賴氨酸比生產(chǎn)速率也降低。在34℃時賴氨酸的平均比生產(chǎn)速率和平均比合成速率均最大，故此溫度是該菌株的最適產(chǎn)酸溫度。此菌株在此溫度下生物量減少，產(chǎn)量增加說明了葡萄糖代謝中碳架流量分布發(fā)生了變化，在賴氨酸的代謝途徑中某些酶的活性有變化，可能是檸檬酸合成酶的基因gltA活性降低和調(diào)節(jié)丙酮酸和NADPH的酶malE活性增加的原因［6－7］。在以上基礎(chǔ)上提出兩階段溫度控制策略，控制的指標主要是根據(jù)菌體濃度來調(diào)控，圖4可以看出當菌體濃度在11.70g/L時產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都是最高，同時結(jié)合圖3得最佳溫度控制策略:0～18h 31℃，18h～最后34℃。同時溫度升高后發(fā)酵時間也相應(yīng)的縮短至60h。

2.2 最適殘?zhí)蔷S持濃度的確定

微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平除取決于菌種本身的性能外，更加注重發(fā)酵條件的調(diào)控，以最少的原料和能源投入，獲得最大產(chǎn)出［8］，尤其是殘?zhí)堑目刂?。如果殘?zhí)菨舛冗^高或過低，對菌體的生長，賴氨酸的產(chǎn)量和賴氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率均不利。

在恒速流加硫酸銨下，連續(xù)流加800g/L的糖溶液，使殘?zhí)堑臐舛染S持在A:0～5g/L、B:5～10g/L、C: 10～15g/L和D:15～20g/L四個水平，比較其對產(chǎn)酸的影響。

圖1 不同溫度下賴氨酸發(fā)酵過程Fig.1 Lysine fermentation under different temperatures

圖2 不同溫度下賴氨酸發(fā)酵過程動力學參數(shù)的變化Fig.2 Kinetics parameters of lysine fermentation under different temperatures

圖3 賴氨酸產(chǎn)生菌的生長曲線Fig.3 The growth curve of lysine strain

由圖5可知當殘?zhí)菨舛染S持在5～10g/L時，產(chǎn)量最高。如果控制殘?zhí)菨舛雀哂诖藵舛?，按Monod方程，當營養(yǎng)物質(zhì)濃度增加到一定量時，生長就顯示飽和動力學，若繼續(xù)增加底物濃度，就可能產(chǎn)生一種基質(zhì)抑制區(qū)，停滯期延長，比生長速率減小，菌體濃度下降等，同時葡萄糖或是其分解代謝產(chǎn)物能夠抑制多種酶或產(chǎn)物的合成［9］，從而引起代謝流量的變化;當?shù)陀诖藵舛葧r產(chǎn)酸下降，可能是發(fā)酵液中的碳源不足以維持細胞合成過量產(chǎn)物的需求。在12～18h內(nèi)殘?zhí)怯绊懖皇呛艽?，主要是培養(yǎng)基中8%的初糖沒有完全消耗，在20h開始補糖后，不同濃度的殘?zhí)菍Ξa(chǎn)量的影響比較明顯。

圖4 不同菌體濃度對賴氨酸發(fā)酵控溫的影響Fig.4 Lysine fermentation under bacteria concentraion

圖5 不同殘?zhí)菨舛葘嚢彼岬挠绊慒ig.5 Effect of residual glucose concentration on L－lysine acid fermentation

2.3 最佳氨氮濃度的確定

以硫酸銨作無機氮源，菌體生長和產(chǎn)酸遠遠優(yōu)于其他無機氮源［10］，這主要是因為硫酸銨不但可供作氮源，而且NH+4與SO2－4可激活賴氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶，有利于賴氨酸的合成［11］。研究滲透壓對賴氨酸的影響時發(fā)現(xiàn)，在整個過程中維持硫酸銨2%時可增加發(fā)酵過程的氧供給［12］。在發(fā)酵過程中氨氮的來源除了硫酸銨還有就是調(diào)pH的氨水，不少文獻都是以恒速流加硫酸銨為指標，沒有直接以氨氮為指標控制更為精確。

在恒速流加葡萄糖的情況下，連續(xù)流加500g/L的硫酸銨，使氨氮的濃度控制在A:0～1g/L，B:1～2g/L，C:2～3g/L，D:3～4g/L四個水平，比較其對產(chǎn)量的影響。

由圖6可知當氨氮濃度維持在1～2g/L內(nèi)產(chǎn)量最大。細胞生長環(huán)境中過高的離子如NH+4會影響物質(zhì)代謝特征、代謝過程中關(guān)鍵酶的活性和細胞中某些成分的生成［13］，從而影響菌體生長和賴氨酸的積累。在12～24h內(nèi)產(chǎn)酸基本上沒有大變化，主要是由于初始培養(yǎng)基中的硫酸銨，玉米漿提供的氮源足以維持前期細胞的生長和產(chǎn)酸;24h～最后通過流加的硫酸銨，中間根據(jù)pH變化自動補加氨水，調(diào)節(jié)所需的氨氮濃度，由圖可知氨氮對賴氨酸產(chǎn)量的影響比殘?zhí)菍嚢彼岬挠绊懘蟆?/p>

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化前后主要發(fā)酵參數(shù)的比較

圖6 不同氨氮濃度對賴氨酸的影響Fig.6 Effect of ammomia nitrogen concentration on L－lysine acid fermentation

表1是在以上優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，發(fā)酵3次得到的平均數(shù)據(jù)。由此可見發(fā)酵條件優(yōu)化效果。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化前后主要發(fā)酵參數(shù)比較Table 1 Comparison of fermentation parametrers before and after optimization

3 結(jié)論

本文通過控制發(fā)酵過程中的溫度，確定了最適生長溫度和最適產(chǎn)酸溫度分別是31℃、34℃，溫度調(diào)控以菌體濃度為指標，發(fā)酵前期(0～18h)控制溫度在31℃，此階段主要是長菌，發(fā)酵中后期(18h～結(jié)束)升溫至34℃，運用兩階段控溫方法不僅使產(chǎn)量提高，而且縮短了發(fā)酵時間，提高了設(shè)備利用率。然后通過連續(xù)流加葡萄糖和硫酸銨，確定了最適殘?zhí)菨舛群妥钸m氨氮濃度，連續(xù)流加很好地解決了抑制性底物濃度對發(fā)酵的影響，解除或減弱分解代謝物的阻遏;同時菌體濃度也降低了，不僅有利于溶氧的調(diào)節(jié)，對后續(xù)提取工藝也有一定的幫助。在以上條件控制下發(fā)酵周期縮短了6h，產(chǎn)量提高了36.0%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了24.5%，生產(chǎn)強度提高了20.4%。

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Study on the conditions of L－lysine acid production with gradient temperature fermentation

LIAN Shao－jie，ZHANG Wei－guo*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Fermentation conditions of Brevibacterium flavum XQ90 for lysine acid production were studied.It was found that the two－stage temperature strategy was better for fermentation(0～18h 31℃，18h～end 34℃)，and fermentation time was decreased to 60h in the new process.At the same time the optimal residual sugar concentration was 5～10g/L，and ammomia nitrogen was 1.0～2.0g/L.As a result，under the optimum fermentation conditions，Lys·HCl productivity was enhanced from 111g/L to 151g/L，and conversation rate from glucose to lysine acid was 50.2%.

Brevibacterium flavum;temperature control;fed－batch fermentation;residual glucose;ammomia nitrogen

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0242－04

L－賴氨酸是人體和動物不能合成的八種必需氨基酸中最重要的一種。賴氨酸是目前國際市場上發(fā)展前景良好的產(chǎn)品，大約每年生產(chǎn)100萬t，消費需求逐年遞增［1］。由于食物中賴氨酸含量很低，加工過程中易被破壞，引起賴氨酸缺乏，故常稱為第一限制氨基酸，其廣泛應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥工業(yè)，在平衡氨基酸組成方面起著重要的作用。全球約90%的賴氨酸用作飼料添加劑，約5%用作食品添加劑，其余5%用作醫(yī)藥中間體［2］。近幾年，飼料級賴氨酸出口市場持續(xù)良好發(fā)展，各大廠家為了爭奪有限的市場份額都有增產(chǎn)或擴廠計劃，市場競爭尤為激烈［3］。為了降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)量，本文主要從溫度、殘?zhí)呛桶钡矫鎭碚{(diào)控整個發(fā)酵過程。微生物的生長和產(chǎn)物的合成均需在其各自合適的溫度下進行。溫度是保證酶活性的重要條件，在發(fā)酵過程中必須保證最適宜的溫度環(huán)境［4］，溫度控制在谷氨酸、乳酸發(fā)酵中應(yīng)用較多，在賴氨酸的生產(chǎn)中較少。為了達到產(chǎn)酸最大化，本文將梯度發(fā)酵溫度策略應(yīng)用于賴氨酸發(fā)酵工藝中，并通過控制殘?zhí)呛桶钡谧钸m范圍內(nèi)，使其發(fā)酵性能得到最大的發(fā)揮，為賴氨酸工業(yè)提供新思路。

2011－06－14 *通訊聯(lián)系人

廉少杰(1985－)，男，碩士研究生，主要從事菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究。