楊 眉，侯長軍，李賢良，霍丹群，黃清菁

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044;2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020)

表面印跡法制備鏈霉素分子印跡聚合物及其性能研究

楊 眉1，侯長軍1，李賢良2，霍丹群1，黃清菁1

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044;2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020)

利用硅膠顆粒為基質(zhì)，在其表面接枝硅烷化試劑3－甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ－MPS)，進(jìn)行硅烷化處理后，以鏈霉素為模板分子，甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)為交聯(lián)劑在顆粒表面合成分子印跡層，制備得到鏈霉素分子印跡聚合物(MIPMs)和空白聚合物(NMIPMs)，并采用靜態(tài)平衡結(jié)合法借助高效液相色譜－蒸發(fā)光散射(HPLC－ELSD)研究了聚合物對模板分子鏈霉素的吸附能力、結(jié)合動力學(xué)和選擇特性。掃描電鏡觀察和紅外光譜分析結(jié)果表明表面印跡層已經(jīng)成功合成;吸附實驗結(jié)果表明，MIPMs比NMIPMs對鏈霉素具有更強的吸附特性和更好的選擇性。

鏈霉素，分子印跡，表面印跡，聚合物，吸附性能

動物源性食品中獸藥殘留問題是近年來國際社會關(guān)注的公共衛(wèi)生熱點之一，受到人們的普遍重視。氨基糖苷類獸藥在預(yù)防和控制動物疫病中發(fā)揮著重要的作用，但臨床已經(jīng)證明此類藥物具有耳毒性和腎毒性，所以其在動物源性食品中的殘留會給人體健康帶來嚴(yán)重的危害。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測殘留方法顯得尤為重要，也成為當(dāng)前研究的熱點問題。目前，動物源性食品中氨基糖苷類藥物殘留的檢測方法主要有微生物檢測法、免疫學(xué)檢測法和大型儀器檢測法等等。微生物檢測法雖然價格便宜，操作簡單，適用于樣品的大批量篩選，但準(zhǔn)確度和靈敏度較低，檢測限達(dá)不到要求，且測定結(jié)果誤差較大。免疫分析法材料生產(chǎn)周期長，成本較高，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要進(jìn)行確證［1］。因氨基糖苷類抗生素紫外吸收較弱，靈敏度低，用高效液相色譜法(HPLC)測定時通常需要衍生化后用熒光檢測器進(jìn)行測定，操作繁瑣。液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC－MS)靈敏度高，選擇性和準(zhǔn)確性好，但儀器昂貴、成本高，對樣品前處理的要求很高。分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology，MIT)是指制備對某一特定的模板分子具有選擇性的分子印跡聚合物(molecular imprinting polymer，MIP)的技術(shù)，具有結(jié)構(gòu)預(yù)定性、特異識別性和廣泛實用性等特點。分子印跡固相萃取技術(shù)由于具有對痕量組分有較強特異性的分離和富集能力，可以提高藥物殘留凈化的選擇性和凈化效果，在食品中獸藥殘留檢測的前處理方面有著巨大的發(fā)展應(yīng)用潛力［2－5］。鏈霉素是一種廣譜的氨基糖苷類抗生素，主要作用于細(xì)胞的核糖體，通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的生物合成而呈現(xiàn)殺菌作用，對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌特別是結(jié)核分枝桿菌具有顯著的抗菌活性，在畜牧業(yè)上得到了廣泛應(yīng)用。但是，鏈霉素作為獸藥和飼料添加劑長期使用會導(dǎo)致動物體內(nèi)藥物的蓄積，并通過食物鏈進(jìn)入人體及生態(tài)系統(tǒng)，危害人類健康和污染環(huán)境。針對目前HPLC及LC－MS檢測動物源性食品中氨基糖苷類抗生素獸藥殘留中樣品前處理和分析過程復(fù)雜繁瑣，普通的固相萃取材料對目標(biāo)物的特異性凈化能力不強，對于痕量殘留物質(zhì)的富集倍數(shù)不高等問題與不足，實驗采用分子印跡技術(shù)制備得到鏈霉素分子印跡聚合物，并對其吸附性能進(jìn)行系統(tǒng)評價，以期為進(jìn)一步作為固相萃取填料提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸鏈霉素、硫酸新霉素、硫酸慶大霉素 純度均大于98.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲基丙烯酸(MAA)、N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺(MBA) 美國Aldrich－Sigma公司;層析硅膠 青島海洋化工廠; 3－甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ－MPS) 南京立派化工有限公司;過硫酸銨、氫氟酸、四氫呋喃、無水乙醇 重慶川東化工有限公司;雙重去離子水MilliQ純水純化系統(tǒng)。

Waters Acquity型高效液相色譜系統(tǒng)，Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢測器，TESCAN VEGA LMU型掃描電子顯微鏡，Spectrum GX型傅立葉變換紅外光譜儀，SHA－C型往復(fù)式水浴恒溫振蕩器。

1.2 實驗方法

1.2.1 硅膠的活化及硅烷化改性 稱取適量干燥硅膠用1%氫氟酸浸泡48h，以除去其表面可能存在的無機雜質(zhì)，并增加硅膠表面的活化羥基數(shù)目［6］，有利于下步反應(yīng)進(jìn)行硅烷化接枝。用去離子水多次離心洗滌，直至上清液近中性。干燥，稱重。

稱取干燥已活化的干燥硅膠1g置于單口燒瓶中，加入乙醇/水(4∶1，V/V)的混合溶液，攪拌且超聲分散;另取10mL γ－MPS加入乙醇/水(4∶1，V/V)的溶液中，超聲水解1h后，倒入上述燒瓶，升溫至70℃，恒溫電磁攪拌反應(yīng)12h;反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，分別用無水乙醇和去離子水多次離心洗滌，直至完全去除未反應(yīng)的硅烷化試劑。干燥，稱重。

1.2.2 鏈霉素分子印跡聚合物制備 稱取1.0g硅烷化后的硅膠，放入40mL四氫呋喃/水(7∶1，V/V)混合溶液中分散;將0.04mmol硫酸鏈霉素和0.16mmol MAA溶于30mL四氫呋喃/水(7∶1，V/V)溶液中，超聲混合均勻后在4℃冰箱中放置過夜形成預(yù)聚合物，再加入0.8mmol MBA混合，加至上述含硅膠的溶液中，通N2攪拌30min;加入少量過硫酸銨，保持?jǐn)嚢韬屯∟2，在65℃溫度下反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，分別用無水乙醇和去離子水多次離心洗滌，直到液相色譜檢測洗脫液中不含鏈霉素分子為止。40℃真空干燥備用［7］?？瞻子≯E聚合物(NMIPMs)以同樣方法制備，只是不加入模板分子。

1.2.3 形貌和成分表征 分別稱取25mg層析硅膠和25mg MIPMs置于小燒杯中，加入1mL乙醇后超聲分散10min，各取微量于清潔處理過的硅片上，干燥后噴金，用SEM對兩種樣品進(jìn)行形貌表征。

以KBr壓片制備樣品，分別檢測 MIPMs和NMIPMs的紅外光譜圖。

1.2.4 動態(tài)吸附性能研究 分別稱取11組等量的MIPMs和NMIPMs各30mg，置于25mL磨口錐形瓶中，加入15mL的1.5μg/mL的硫酸鏈霉素水溶液，25℃條件下進(jìn)行振蕩吸附0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20、24h，將各混合液轉(zhuǎn)入離心管，離心，上清液用HPLC－ELSD測定［8］，分析MIPMs和NMIPMs對鏈霉素的動態(tài)吸附情況。根據(jù)吸附前后溶液中鏈霉素濃度的變化，由式(1)計算出聚合物對鏈霉素的吸附量Q(μg/mg)，平行3次取平均值，繪出吸附量Q與振蕩吸附時間關(guān)系的動力學(xué)曲線。

式中，C0、Cv分別表示吸附前、后溶液中鏈霉素的濃度(μg/mL);V為鏈霉素水溶液的加入量(mL);m為聚合物的加入量(mg)。

1.2.5 靜態(tài)吸附性能研究 稱取6組等量的MIPMs和NMIPMs各30mg，分別置于25mL磨口錐形瓶中，并依次加入濃度為0.1、0.3、0.6、1.0、1.5、2.0μg/mL鏈霉素水溶液15mL，25℃條件下進(jìn)行振蕩吸附24h，將各混合液轉(zhuǎn)入離心管，離心，上清液用HPLC－ELSD測定。再利用吸附前后的濃度差值，即可計算出MIPMs和NMIPMs的平衡吸附量Q。

1.2.6 選擇吸附性能研究 稱取3組等量MIPMs和NMIPMs各30mg，分別置于25mL磨口錐形瓶中，在第1組錐形瓶中加入濃度為1.5μg/mL硫酸鏈霉素水溶液，第2組錐形瓶中加入濃度為1.5μg/mL硫酸新霉素水溶液，第3組錐形瓶中加入濃度1.5μg/mL硫酸慶大霉素水溶液，后續(xù)步驟同上述吸附實驗操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌表征

圖1為硅膠顆粒和MIPMs的SEM圖。從圖2可以看出，MIPMs的粒徑比硅膠顆粒的粒徑稍大些，表面明顯覆蓋有凹凸不平的聚合物層，外觀形貌的變化證實了表面印跡法的可行性，實驗成功制備得到了以硅膠為基質(zhì)的分子印跡聚合物顆粒。

圖1 硅膠顆粒(a)和鏈霉素分子印跡聚合物(b)的SEM圖Fig.1 Scanning electron microscopic(SEM)images of(a) SiO2particles and(b)MIPMs

2.2 化學(xué)成分分析

未洗脫分子印跡聚合物MIPMs和NMIPMs的紅外光譜對比如圖2所示。從圖2可以看出，MIPMs中明顯多出特征吸收峰3424cm－1，它是鏈霉素中多羥基的伸縮振動峰，另一處新吸收峰1658cm－1為鏈霉素中酰胺基團的伸縮振動峰，由此可以說明未洗脫的MIPMs中存在鏈霉素分子，實驗成功合成了分子印跡聚合物。

圖2 NMIPMs(a)和未洗脫的MIPMs(b)的紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of NMIPMs(a)and MIPMs(b)

2.3 吸附動力學(xué)研究

配制系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的硫酸鏈霉素溶液，利用HPLC－ELSD進(jìn)行檢測，得到鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖3所示，在0.05～2.5μg/mL范圍內(nèi)溶液濃度與峰面積之間有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y= 245990X－14724，R2=0.9998。

吸附量Q與振蕩吸附時間關(guān)系的動力學(xué)曲線如圖4所示。從圖中可以看出，MIPMs和NMIPMs對溶液中的鏈霉素均有一定程度的吸附，隨著吸附時間的延長，對鏈霉素的吸附量逐漸增大。初始階段吸附量增加較快，但后期吸附量的增加逐漸趨于平緩，到達(dá)16h后吸附量隨時間延長而變化不大，因此可以確定吸附達(dá)到平衡的時間為16h。另外還可以明顯地觀察到，MIPMs的吸附量始終比NMIPMs的吸附量大，這是由于MIPMs經(jīng)洗脫后表面產(chǎn)生大量印跡空穴，對鏈霉素產(chǎn)生穩(wěn)定的特異性吸附，所以其吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NMIPMs表面非特異性的吸附量。

圖3 鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Fig.3 Standard curves of streptomycin

圖4 MIPMs和NMIPMs的吸附動力學(xué)曲線Fig.4 Curve of adsorption dynamic of MIPMs and NMIPMs

2.4 平衡吸附量研究

MIPMs和NMIPMs對不同初始濃度鏈霉素的吸附量如圖5所示，當(dāng)起始濃度為0.1、0.3、0.6、1.0、1.5、2.0μg/mL時，MIPMs和NMIPMs的吸附量都隨鏈霉素濃度的增加而增加，但NMIPMs對鏈霉素的平衡結(jié)合量明顯低于MIPMs。這是因為NMIPMs表面暴露的游離－COOH等其他基團會對鏈霉素產(chǎn)生不穩(wěn)定的非特異性吸附;但MIPMs經(jīng)洗脫后表面產(chǎn)生大量印跡空穴，對鏈霉素產(chǎn)生穩(wěn)定的特異性吸附，其結(jié)合量遠(yuǎn)大于NMIPMs表面產(chǎn)生的非特異性吸附，因此MIPMs對鏈霉素的結(jié)合量明顯大于NMIPMs。

圖5 MIPMs和NMIPMs的等溫吸附曲線Fig.5 Binding isotherms of MIPMs and NMIPMs at different concentrations of streptomycin

根據(jù)上述吸附量數(shù)據(jù)，通過 Scatchard模型對MIPMs的吸附特性進(jìn)行分析:

式中，Q為吸附平衡時MIPMs對鏈霉素的結(jié)合量(μg/mg)，F(xiàn)為吸附平衡時溶液中游離鏈霉素的濃度(μg/mL)，Qmax為最大表觀結(jié)合量，KD為結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)。

將實驗中得到的MIPMs對鏈霉素的結(jié)合量式(2)以游離比(Q/F)對Q作圖，得到圖6所示Scatchard分析圖，非線性關(guān)系表明存在不等價的結(jié)合位點。在圖6中存在兩個明顯的部分分別有良好的線性關(guān)系，證明在研究的濃度范圍內(nèi)，MIPMs主要存在兩類不同的結(jié)合位點與鏈霉素進(jìn)行作用。對2個線性部分分別進(jìn)行擬合，由斜率和截距可分別求得高親和位點的解離常數(shù)KD1=0.625μg/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax1=1.254μg/mg，低親合位點解離常數(shù)為KD2=0.861μg/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax2=0.829μg/mg。

圖6 MIPMs的Scatchard分析圖Fig.6 Scatchard plots to estimate the binding nature of MIPMs

2.5 選擇吸附性能研究

圖7所示為MIPMs和NMIPMs分別與鏈霉素、新霉素和慶大霉素三種氨基糖苷類抗生素的結(jié)合量比較。其中，NMIPMs由于表面產(chǎn)生有非特異性吸附，分別對這三種化合物有一定程度的吸附，但是吸附量均小于MIPMs對其的吸附量;MIPMs對三種化合物的吸附量大小依次為:鏈霉素＞新霉素＞慶大霉素。鏈霉素、新霉素和慶大霉素三種氨基糖苷類抗生素的分子結(jié)構(gòu)見圖8，從圖8中可以看出，新霉素的結(jié)構(gòu)和位點比起慶大霉素與鏈霉素更為接近，因而吸附量次之。MIPMs對鏈霉素的吸附量最大，這說明MIPMs表面對鏈霉素形成了從三維空間和結(jié)合位點上可特異性結(jié)合的識別空穴，具有較好的選擇性能。

圖7 MIPMs及NMIPMs對鏈霉素、新霉素和慶大霉素的吸附量對比圖Fig.7 Absoption capacity of MIPMs and NMIMPs for different substrates

3 結(jié)論

本文以硅膠顆粒為基質(zhì)，利用表面印跡聚合法制備了鏈霉素分子印跡聚合物(MIPMs)。掃描電鏡和紅外分析結(jié)果證實了表面印跡聚合層已經(jīng)成功合成。吸附動力學(xué)研究結(jié)果顯示吸附達(dá)到平衡的時間為16h，而靜態(tài)吸附研究結(jié)果表明MIPMs對鏈霉素的吸附量比NMIPMs更大，并通過Scatchard分析得到，MIPMs主要存在兩類不同的結(jié)合位點與鏈霉素進(jìn)行作用，高親和位點的解離常數(shù)KD1=0.625μg/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax1=1.254μg/mg，低親合位點解離常數(shù)為 KD2=0.861μg/mL，最大表觀結(jié)合量 Qmax2= 0.829μg/mg，并且與新霉素和慶大霉素相比，MIPMs對鏈霉素具有更好的選擇吸附性能。

圖8 鏈霉素、新霉素和慶大霉素的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.8 Structural formula of streptomycin，neomycin and gentamicin

［1］Chen Y Q，Shang Y H，Li X M，et al.Development of an enzyme－linked immunoassay for the detection of gentamicin in swine tissues［J］.Food Chemistry，2008，108(1):304－309.

［2］Shi X，Meng Y，Liu J，et al.Group－selective molecularly imprinted polymer solid－phase extraction for the simultaneous determination of six sulfonamides in aquaculture products［J］. Joumal of Chromatography B，2011，879(15－16):1071－1076.

［3］Hu Y L，Liu R J，Li Y W，et al.Investigation of ractopamineimprinted polymer for dispersive solid－phase extraction of trace beta－agonists in pig tissues［J］.Journal of Separation Science，2010，33(13):2017－2025.

［4］Sun X，He X，Zhang Y，et al.Determination of tetracyclines in food samples by molecularly imprinted monolithic column coupling with high performance liquid chromatography［J］.Talanta，2009，79(3):926－934.

［5］Kootstra P R，Kuijpers C J P F，Wubs K L，et al.The analysis of beta－agonists in bovine muscle using molecular imprinted polymers with ion trap LCMS screening［J］.Analytica Chimica Acta，2005，529(1－2):75－81.

［6］王偉山，易紅玲，鄭柏存，等.甲基丙烯酸甲酯對納米SiO2的表面接枝聚合改性研究［J］.化工新型材料，2009，37(9): 83－86.

［7］Ma J，Yuan L H，Ding M J，et al.The study of core－shell molecularly imprinted polymers of 17 β－estradiol on the surface of silica nanoparticles［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，26 (5):2791－2795.

［8］張雷.HPLC－ELSD法分析硫酸鏈霉素的含量［J］.中國抗生素雜志，2009，34(3):168－169.

Study on synthesis and characterization of molecularly imprinted polymers of streptomycin by surface imprinting polymerization

YANG Mei1，HOU Chang－jun1，LI Xian－liang2，HUO Dan－qun1，HUANG Qing－jing1
(1.College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China; 2.Chongqing Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400020，China)

Silicon dioxide(SiO2)particlesweretreated withsilane and theirsurface weregrafted with 3－(methacryloxypropyl)－trimethoxysilane(γ－MPS).Subsequently molecularly imprintedmembrane was synthesized on the surface of SiO2particles，where streptomycin was used as the template molecule，methacrylic acid(MAA)was used as functional monomer and N，N'－Methylenebisacrylamide(MBA)was used as cross linker. Finally，molecularly imprinted polymer(MIPMs)and non－molecularly imprinted polymer(NMIPMs)were prepared by surface imprinting polymerization.The morphology of MIPMs was characterized by means of scanning electron microscopy(SEM).Infrared spectra of MIPMs and NMIPMs demonstrated the components of them.The experimental results of isotherm binding of MIPMs and NMIPMs at different concentrations of streptomycin indicated that MIPMs absorbedmore substrates than NMIPMs.MIPMs also showedgoodselectivity for streptomycin through the isotherm binding test of two other different substrates which were neomycin and gentamicin.

streptomycin;molecularly imprinted;surface imprinted;polymer;absorption properties

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0155－04

2011－07－07

楊眉(1980－)，女，博士，講師，研究方向:分析檢測材料。

國家自然科學(xué)基金項目(31000425);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費資助項目(CDJZR10230005);國家質(zhì)檢總局科研計劃檢驗檢疫領(lǐng)域項目(2011IK254);重慶大學(xué)大型儀器設(shè)備開放基金項目(2010063061)。