王吉中，耿盧婧，席攀攀，許春平

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002)

發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖的分析及其在卷煙中的應用

王吉中，耿盧婧，席攀攀，許春平*

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002)

對發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖進行提取和脫蛋白處理得到精制云芝胞外多糖，之后過Sepharose CL－6B凝膠柱得到一個多糖組分，然后用紅外光譜技術對該多糖組分的結構進行表征得知其為酸性多糖;將精制云芝胞外多糖以不同的濃度注入卷煙中，利用吸煙機捕集煙氣粒相物計算出云芝胞外多糖在煙氣中的轉移率在2.76%～4.78%之間變動;用單料煙絲進行加香評吸實驗，結果表明在精制胞外多糖添加量為0.04%時明顯地改善了卷煙的吸食品質，起到掩蓋雜氣，去除刺激，改善余味的作用，使香氣細膩程度有所提升。這為發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖在卷煙中的應用提供了一定的理論支持。

云芝，胞外多糖，轉移率，感官評價

1 材料與方法

1.1 材料與設備

云芝菌株 為本實驗室保藏;精制胞外多糖儲備液 10mg/mL，溶劑為蒸餾水;散花成品煙 重量0.83g，煙支吸阻1050Pa，煙支規(guī)格84mm×24.5mm，濾嘴長30mm;單料煙絲 云南宣威HC1F。

Bruker TENSOR27紅外光譜儀 德國FT－IR; CXG－1電腦恒溫層析柜 上海青浦瀘西儀器廠; Waters2487紫外檢測器 美國water;UV1700PC紫外可見分光光度計 中國Phenix;METTLER 4E200電子分析天平 上海沛歐分析儀器有限公司; RE－52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠; LM5+吸煙機 德國Borgwaldt。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖組分分析 云芝發(fā)酵結束后，通過真空抽濾法分離菌絲與發(fā)酵液，用醇提法從發(fā)酵液中提取得胞外粗多糖［14］，然后用Sevag法脫蛋白［15］，經(jīng)真空冷凍干燥得精制胞外多糖。稱取80mg云芝精制胞外多糖溶于4mL 0.2mol/L的NaCl緩沖液，離心，上清液過0.45μm濾膜;取2mL上Sepharose CL－6B凝膠柱，以0.2mol/L NaCl緩沖液洗脫，流速為 0.6mL/min，利用分步收集器收集，5mL/管;用硫酸－苯酚法對胞外多糖進行檢測。分離出的胞外多糖組分用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000～14000u)除去NaCl，真空冷凍干燥保存。

1.2.2 云芝胞外多糖組分紅外光譜分析(IR) 稱取過柱得云芝胞外多糖組分1mg，用溴化鉀(KBr)壓片后進行紅外光譜(IR)分析。

1.2.3 精制云芝胞外多糖在煙氣中轉移率的測定

取不同體積精制胞外多糖儲備液并加蒸餾水補充到0.5mL;注射進散花成品煙中，使煙支中胞外多糖含量分別達到煙支質量的 0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%，并做注射0.5mL蒸餾水的空白對照，每組10支;放入恒溫恒濕箱(溫度22℃，濕度60%)平衡48h;然后用吸煙機對煙支進行抽吸;將抽吸后的劍橋濾片放入150mL三角瓶中，加入50mL無水乙醇超聲1h，倒掉乙醇，然后加入50mL無水乙醇超聲0.5h，倒掉乙醇，再加入50mL蒸餾水超聲兩次，每次1h，合并濾液，用硫酸－苯酚法測定多糖含量，計算其在煙氣中轉移率。

1.2.4 精制云芝胞外多糖在卷煙中的感官評價 稱取云南宣威HC1F單料煙絲4份，10g/份;之后取不同體積精制胞外多糖儲備液并加蒸餾水補充到0.5mL，用微型噴霧器均勻噴灑在各組煙絲中，使胞外多糖含量分別達到煙絲質量的0.0%、0.01%、0.04%、0.08%，按照每支0.83g的標準制備卷煙;然后放入恒溫恒濕箱(溫度22℃，濕度60%)平衡48h。待平衡好后請鄭州輕工業(yè)學院食品與生物學院的卷煙感官評吸小組進行評吸，從卷煙的香氣質、香氣量、濃度、細膩、雜氣、刺激、余味等方面篩選出感官質量較好的樣品［7］，確定云芝胞外多糖在卷煙中的添加量及其應用效果。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖組分分析

將精制云芝胞外多糖樣品過Sepharose CL－6B柱，用硫酸－苯酚法測定多糖含量，以管號為橫坐標以多糖吸光度為縱坐標用SigmaPlot軟件作圖，結果如圖1所示。

從圖1可以看出，精制云芝胞外多糖經(jīng)過Sepharose CL－6B柱分離出一種主要多糖組分。重復過柱5次，每次都對過柱后的溶液進行檢測，檢測結果相同，將5次所得到的組分收集起來進行濃縮、透析、冷凍干燥得到一個多糖組分。

圖1 精制云芝胞外多糖過Sepharose CL－6B層析柱結果Fig.1 Elution profile of EPS of C.versicolor in Sepharose CL－6B chromatography.

2.2 過柱得云芝胞外多糖組分紅外光譜分析

對過柱得云芝胞外多糖組分進行紅外光譜監(jiān)測得紅外光譜圖，結果見圖2。

圖2 過柱得云芝胞外多糖組分的紅外光譜圖Fig.2 The FT－IR spectra of the purified EPS fraction of C.versicolor

從圖譜中特征吸收波峰分析可知，在3421.4cm－1有一特征寬峰，屬O－H的伸縮振動，表明在該糖中應存在O－H;在2926.1cm－1處有吸收峰，應為C－H伸縮振動，是糖類的特征吸收峰，在2361、2335.8cm－1處有吸收峰，應為C=N或C=C伸縮振動，發(fā)生費米共振;在1645.7、1071.9cm－1處有吸收峰，說明該組分中有羧酸存在，推知該胞外多糖組分為酸性多糖。

2.3 精制云芝胞外多糖在煙氣中轉移率的測定

將精制云芝胞外多糖溶液以不同的濃度注入卷煙中，經(jīng)吸煙機抽吸后，利用硫酸苯酚法測定卷煙煙氣中的多糖含量，并扣除空白對照卷煙煙氣中多糖含量，計算精制云芝胞外多糖在煙氣中的轉移率［16－17］，結果見圖3。

由圖3可知，精制云芝胞外多糖在煙氣中的轉移率隨其在卷煙中濃度的增加出現(xiàn)了先增加后減少的變化趨勢，在多糖添加量為0.02%時，轉移率為2.76%，在多糖添加量為0.06%時，轉移率為4.78%，而多糖添加量超過0.06%達到0.1%時，多糖在煙氣中的轉移率為3.82%。

2.4 精制云芝胞外多糖在卷煙中的感官評價

精制云芝胞外多糖在卷煙中的加香實驗評吸結果見表1。結果表明:在添加濃度為0.04%時，精制云芝胞外多糖在卷煙中能有效地起到掩蓋雜氣，去除刺激，改善余味的作用，使香氣細膩程度有所提升，煙氣狀態(tài)、圓潤感較好，香氣的協(xié)調性好，具有明顯的中草藥特征香，有助于提高卷煙的吸食品質。

表1 精制云芝胞外多糖在卷煙中的感官評價Table 1 The sensory evaluation of the purified EPS fraction of C.versicolor in the cigarette

圖3 精制云芝胞外多糖在卷煙煙氣中的轉移率Fig.3 The transfer rate of the purified EPS fraction of C.versicolor in the cigarette smoke

3 結論

云芝發(fā)酵液經(jīng)醇提、Sevag法脫蛋白質并經(jīng)Sepharose CL－6B凝膠柱分離得到一個多糖組分，通過紅外光譜分析得出該糖為酸性多糖;轉移率測定的結果表明云芝胞外多糖在煙氣中具有較好的轉移率，為云芝胞外多糖可在卷煙當中的添加提供了理論支持，同時加香實驗證明了發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖可起到烘托香氣風格的作用，改善了卷煙的吸食品質，為云芝胞外多糖在卷煙中的添加提供了可行性證據(jù)。總之，該研究結果為云芝胞外多糖及其他藥用真菌在卷煙等相關食品行業(yè)中的應用提供了一定的理論和技術支撐。

［1］于清偉，王明才，薛會麗.云芝菌絲體液體培養(yǎng)條件的研究［J］.山東農(nóng)業(yè)科學，2009(11):80－82.

［2］鄒巧根，朱玲.云芝肽糖的研究進展［J］.中成藥，2003，25 (7):578－580.

［3］程光宇，吳國榮，鄒玉珍.深層培養(yǎng)云芝菌絲體蛋白多糖的提取及性質［J］.植物資源與環(huán)境，1998，7(4):19－23.

［4］牛曉暉，紀鳳蘭，張偉.云芝多糖藥理作用研究進展［J］.特產(chǎn)研究，2004，12(2):57－60.

［5］張勁松，樊華，李玉祥.幾種藥用真菌粗提物對多種人體腫瘤細胞株增殖的抑制作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，12(2):27－31.

［6］李俊峰.云芝的生物學特征、藥理作用及應用前景［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2003，3l(3):509－510.

［7］許永，向能軍，繆明明.中草藥添加劑在卷煙中的應用［J］.云南化工，2007，34(4):67－74.

［8］祁俊生.中草藥添加劑對煙氣相自由基的影響［J］.西南民族學院學報，1998，24(1):31－32.

［9］Hoffmann D，Hoffmann I，El－Bayoumy K.The less harmful cigarette:A controversial issue.A Tribute to ernst L.Wynder［J］. Chem Res Toxicol，2001(14):767－790.

［10］張穎璞，陳篤建，張國強.中草藥在中式低危害卷煙中的應用［J］.科技信息，2008(11):33－34.

［11］史宏志.美國煙草業(yè)的挑戰(zhàn)和減害研究的歷史與現(xiàn)狀［J］.煙草科技，2004(4):8－11.

［12］孟冬玲，劉紹華.中草藥添加劑在中國卷煙中的應用研究進展［J］.中國煙草科學，2006(3):19－21.

［13］鄭新章，張仕華，邱紀青.卷煙降焦減害技術研究進展［J］.煙草科技，2003(1):8－13.

［14］王永敏，祝文興，安利國，等.蛹蟲草胞外多糖的提取純化及免疫活性研究［J］.食品與藥品，2009，11(3):8－11.

［15］齊慧玲，魏紹云，王繼倫，等.Sevag法去除蛋白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000(3):20－21.

［16］David Bernharda，ChristianW，Thomas Jakschitz，et al. Development and evaluation of an invitro model for the analysis of cigarette smoke effects on cultured cells and tissues［J］.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2004，50(1): 45－51.

［17］劉玉紅，王鳳山.真菌多糖結構研究進展［J］.中國藥學雜志，2007，42(8):561－564.

Analysis of exopolysaccharides from fermented Coriolus versicolor and its application on tobacco flavour

WANG Ji－zhong，GENG Lu－jing，XI Pan－pan，XU Chun－ping*(College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

Exopolysaccharides(EPS)were extracted by ethanol from fermented fungi Coriolus versicolor，and purified by gel filtration chromatography on Sepharose CL－6B.The preliminary characterization of EPS was elucidated by IR，and EPS was an acidic carbohydrate.Different concentrations of EPS from Coriolus versicolor were injected in cigarettes，and calculated the transfer rates.It was showed that the transfer rate of EPS in gas was in the rage of 2.76%～4.78%and the adding 0.04%EPS could improve the quality，cover the smoking foreign gas，remove stimulus，and improve aroma aftertaste，fruity feeling and coordination.The results provided a strong support for the application of EPS in cigarette industry.

Coriolus versicolor;exopolysaccharide;transfer rate;sensory evaluation

TS201.2+3

A

1002－0306(2012)08－0140－03

云芝(Coriolus versicolor)又稱為彩絨革蓋菌，是常見且應用最為廣泛的中草藥之一。云芝中含有云芝糖肽、云芝多糖等多種有效藥用成分，其中云芝多糖是國際公認的高效免疫促進劑［1－2］。據(jù)報道，云芝多糖是一種口服有效的多糖［3］，臨床可用于治療慢性乙型肝炎、酒精肝，加強消化系統(tǒng)、肺及宮頸、乳腺等部位的癌癥放化療作用，可明顯提高患者的細胞免疫功能和體液免疫功能，增強機體對化學治療的耐受性，減少感染與出血，提高患者生命質量［4－6］。還有研究表明，含有云芝等類中草藥有效成分的卷煙在燃吸時，其有效成分被蒸餾、氣化、揮發(fā)和升華形成微粒相和氣相，可捕獲煙氣中的自由基，阻斷或降低有害物質的生成，減輕吸煙引起的心血管和微循環(huán)系統(tǒng)的危害［7－10］。因此，煙用中草藥的研究目前已成為各煙草企業(yè)和科研院所研究的熱點之一［11－13］，但目前，還未見發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖用于卷煙中的相關報道。實驗對發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖進行了提取分離和結構分析，并對其在卷煙中的應用效果進行初步研究，為進一步研究中草藥在卷煙中的應用提供理論基礎。

2011－04－13 *通訊聯(lián)系人

王吉中(1975－)，男，碩士，講師，研究方向:生物技術。

鄭州市科技計劃(10PTGG339，112PPTGY249);鄭州輕工業(yè)學院校博士基金(20100426)。