仲月明，張傳麗，陳 鵬，*，沈丹紅，吳秋月，周長遠(yuǎn)

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009; 2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009)

銀杏類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的高效液相色譜分析

仲月明1，張傳麗2，陳 鵬1，*，沈丹紅1，吳秋月1，周長遠(yuǎn)1

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009; 2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009)

首次明確了銀杏葉片類黃酮生物代謝關(guān)鍵酶O－甲基轉(zhuǎn)移酶(flavonoid O－methyltransferase，F(xiàn)OMT)活性的HPLC測定技術(shù)與方法。采集揚(yáng)州大學(xué)銀杏種質(zhì)資源圃銀杏雄株成熟葉片，提取粗酶液，根據(jù)FOMT催化反應(yīng)生成S－腺苷－L－高半胱氨酸(SAH)的原理，以山奈酚、槲皮素和異鼠李素等3種黃酮苷元為反應(yīng)底物，采用優(yōu)化的HPLC體系檢測樣品中FOMT催化反應(yīng)生成的SAH峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得不同反應(yīng)底物的FOMT相對(duì)活性。FOMT活性反應(yīng)生成物SAH在1.5～20μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，RSD為2.1%(n=5)，建立了FOMT活性測定優(yōu)化體系。不同反應(yīng)底物的FOMT活性表現(xiàn)不同，山奈酚與異鼠李素顯著高于槲皮素。FOMT活性HPLC測定方法準(zhǔn)確、快速、可靠、靈敏度高。

銀杏，雄株，葉片，類黃酮O－甲基轉(zhuǎn)移酶(FOMT)活性，高效液相色譜

銀杏(Ginkgo biloba L.)素有“活化石”之稱，集食用、保健、藥用、生態(tài)和觀賞等價(jià)值于一體。其葉片已得到規(guī)?；_發(fā)利用并發(fā)展成為集約化、標(biāo)準(zhǔn)化經(jīng)營的國際性重大產(chǎn)業(yè)［1－3］。銀杏葉中類黃酮是次生代謝產(chǎn)物，是銀杏葉的主要功能性成分。其主要包括單黃酮、雙黃酮和兒茶素等3類。其中具有生物活性的單黃酮類化合物主要由山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)和異鼠李素(isorhamnetin)等黃酮苷元及其與有關(guān)糖類結(jié)合而成的糖苷組成(圖1)。其可以改善心腦血管循環(huán)，清除體內(nèi)自由基，具有提高自身免疫力和抗氧化、抗衰老、抗癌、抗菌、抗過敏及保護(hù)肌膚等功效。上述三種黃酮苷元是黃酮類化合物的主要成分，也是銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)質(zhì)量控制的主要檢測對(duì)象。FOMT是類黃酮合成的關(guān)鍵酶，其催化S－腺苷甲硫氨酸(S－adenosyl－L－methionine，SAM)中－CH3以O(shè)－C鍵方式轉(zhuǎn)移到類黃酮的A、B環(huán)上，生成類黃酮甲基衍生物和S－腺苷－L－高半胱氨酸(S－adenosyl－L－h(huán)omocysteine，SAH)(圖2)，這不僅可以降低類黃酮的化學(xué)反應(yīng)活性，而且可以增加其脂溶性，擴(kuò)大其在細(xì)胞內(nèi)的分布范圍［4］，賦予類黃酮更多的生理生化特性。酶活性測定有定時(shí)、連續(xù)監(jiān)測和平衡等方法，由于受到反應(yīng)濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及試劑等的影響，且有的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工，因而其在應(yīng)用中受到一定限制。近年來采用高效液相色譜 法 (High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC)高效、快速測定酶活性的研究較多［5－7］。本研究首次以銀杏雄株葉片為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)其催化反應(yīng)底物黃酮苷元生成SAH的原理，采用HPLC檢測分析，從而確定FOMT的活性，為銀杏優(yōu)質(zhì)葉用資源的選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

圖1 銀杏單黃酮基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of single flavones of Ginkgo

圖2 植物類黃酮甲基化模式圖Fig.2 The pattern of plant flavones methylation

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5株銀杏雄株葉片 揚(yáng)州大學(xué)銀杏種質(zhì)資源圃，液氮研磨、加提取緩沖液(1∶5，w/v)、過濾、離心、粗酶提取;槲皮素、異鼠李素、山奈酚 上海同田生物有限公司，純度＞98%;S－腺苷－L－高半胱氨酸SAH標(biāo)準(zhǔn)品、S－腺苷－L－甲硫氨酸SAM 美國Sigma公司，純度 ＞98%;辛烷磺酸鈉 美國 Alfa公司; 25mmol/L MgCl2Takara公司;甲酸銨、甲酸、DMSO、甲醇(色譜純) 上海生物工程有限公司;怡寶水 南京大吉泉水飲料有限公司。

LC－10AT高效液相色譜儀 配有島津LC－10A泵、SPD－10A紫外檢測器、77251進(jìn)樣閥，日本島津儀器有限公司;水浴鍋(SHA－C) 國華儀器有限公司;多用循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器有限公司;3K－15型高速冷凍離心機(jī) Sigma公司;KQ－500B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FOMT活性HPLC測定分析的技術(shù)路線 銀杏雄株葉片F(xiàn)OMT活性HPLC測定的技術(shù)流程如圖3所示。在HPLC檢測前，整個(gè)過程需要在低溫條件下進(jìn)行，從而保證酶的活性。

圖3 銀杏雄株葉片F(xiàn)OMT活性HPLC測定分析流程圖Fig.3 Flowchart of analysis on FOMT activity by HPLC for the male leaves in Ginkgo

1.2.2 色譜條件 色譜柱:采用DiamonsilTM(鉆石) C18柱(4.6mm×150mm，5μm);流動(dòng)相為甲酸銨－甲醇溶液(7∶40)［8－9］，稱取甲酸銨5.04g，辛烷磺酸鈉0.8g，加水溶解，甲酸調(diào)節(jié) pH至3.48，加水稀釋至800mL，加甲醇140mL，混勻，流速為1.0mL/min，紫外檢測波長為258nm，柱溫為28℃;進(jìn)樣15μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取SAH先溶于少量50%的DMSO中，然后用流動(dòng)相將其配制為母液，母液再進(jìn)行逐級(jí)稀釋，分別配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液為20、15、10、5、2.5、1.5μg/mL，0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣15μL，記錄色譜圖，以SAH峰面積(A)為橫坐標(biāo)，SAH濃度(C)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 酶活性單位 酶活性單位的定義為:在下述測定條件下，每30min生成SAH 1pmoL的酶量為1個(gè)活性單位U。

1.2.5 FOMT粗酶液提取 參照Paolo、Sabrina等文獻(xiàn)［5－6，10－11］確定FOMT粗酶提取方法:取銀杏雄株新鮮葉片20g，液氮研磨，加入100mL提取緩沖液(1∶5，w/v);過濾，離心，取上清液。

1.2.6 FOMT活性測定體系優(yōu)化

1.2.6.1 溫度影響酶活性變化曲線 酶量恒定(200μL)，反應(yīng)30min，山奈酚為底物，反應(yīng)溫度設(shè)定為20、25、30、35、40、45℃。0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣15μL，記錄色譜圖，保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.2.6.2 pH影響酶活性變化曲線 酶量恒定(200μL)，反應(yīng)30min，山奈酚為底物，緩沖液pH設(shè)為5、6、7、7.5、8、9、10。0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣15μL，記錄色譜圖，保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.2.6.3 底物濃度影響酶活性變化曲線 酶量恒定(200μL)，反應(yīng)30min，山奈酚為底物，底物濃度分別為20、50、100、200、400μmol/L。0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣15μL，記錄色譜圖，保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.2.7 不同底物FOMT活性測定比較 將5株雄株葉片混合，分別以山奈酚、異鼠李素、槲皮素為底物，應(yīng)用優(yōu)化的酶活反應(yīng)體系測定FOMT活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 FOMT粗酶液提取及其反應(yīng)底物的選用

參照Paolo、Sabrina等文獻(xiàn)［5－6，10－11］確定提取緩沖液為Tris－Hcl(8.0)50mmol/L，EDTA 1mmol/L，PMSF 1mmol/L，NaCl 50mmol/L，Triton X－100 0.1% (v/v);4層紗布過濾，4℃，11000r/min離心30min，取上清液。粗酶液保存于－20℃?zhèn)溆?。粗酶提取過程需在低溫下進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程選擇在冰上完成。

山奈酚、槲皮素和異鼠李素是具有生物活性的黃酮苷元，也是GBE質(zhì)量檢測的主要指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇其分別作為酶活反應(yīng)底物。

2.2 HPLC條件的選擇與優(yōu)化

選取不同比例的甲醇－甲酸銨溶液進(jìn)行分離度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示甲醇和甲酸銨溶液的比例為7∶40時(shí)，出峰效果最好。流動(dòng)相的pH對(duì)雜質(zhì)的分離度有較大影響，pH越小，雜質(zhì)分離度越大?？紤]到pH過低容易對(duì)色譜柱產(chǎn)生損害，實(shí)驗(yàn)選取pH 3.0～4.0范圍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH為3.48時(shí)，SAH的出峰及保留時(shí)間都較穩(wěn)定，可以滿足含量測定的要求。本文選擇不同柱溫進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示溫度對(duì)測定結(jié)果影響較大，溫度越高保留時(shí)間越短，本實(shí)驗(yàn)選擇接近室溫的28℃為柱溫，容易確保實(shí)驗(yàn)條件的一致性。SAH的保留時(shí)間為14min左右。具體色譜圖見圖4、圖8～圖10。

2.3 SAH溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及色譜圖

以SAH峰面積(A)為橫坐標(biāo)，SAH濃度(C)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到SAH濃度相應(yīng)于SAH峰面積的線性回歸方程為:y=6E－07x+0.3135，r= 0.9991(n=6);即SAH濃度1.5～20μg/mL內(nèi)，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。由圖4得知，采用SAH對(duì)照品進(jìn)樣分析，確定 SAH的保留時(shí)間為14min左右。

圖4 SAH標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of SAH in standard solution

2.4 HPLC檢測精密度實(shí)驗(yàn)

取SAH對(duì)照品20μg/mL溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積和保留時(shí)間并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果表明 SAH的RSD為2.1%，精密度良好。

2.5 HPLC檢測回收率實(shí)驗(yàn)

取樣品20μL，加入對(duì)照品20μg/mL溶液20μL，混勻，取15μL上樣，重復(fù)進(jìn)樣3次。計(jì)算SAH的加樣回收率，結(jié)果為100.7%。

2.6 FOMT活性的HPLC測定

2.6.1 酶活反應(yīng)體系優(yōu)化

2.6.1.1 酶促反應(yīng)隨溫度的變化 本研究設(shè)定6個(gè)溫度值來探明銀杏中FOMT活性反應(yīng)的最適溫度條件，由圖5可知，銀杏FOMT活性反應(yīng)最適溫度為25℃。不同植物FOMT活性反應(yīng)的最適溫度稍有不同，康乃馨FOMT活性反應(yīng)溫度為25℃［10］，菊科麻花FOMT為30℃［5］，大麥中 FOMT為20℃［12］，結(jié)果表明，銀杏FOMT活性反應(yīng)最適溫度與其他植物的比較接近。

圖5 酶促反應(yīng)隨溫度的變化Fig.5 Changes of enzymatic reaction in the different temperatures

2.6.1.2 酶促反應(yīng)隨pH變化 FOMT維持活性的最適pH為7.0～8.0，不同來源稍有差異。本研究選取6個(gè)pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示銀杏FOMT活性反應(yīng)的最適pH范圍為7.5～8.0。說明銀杏FOMT維持活性的pH在正常范圍內(nèi)。與其他植物差異不大，如康乃馨FOMT最適pH為中性范圍，麻花FOMT為7.6，鳶尾FOMT為7.5～8.0［13］。

圖6 酶促反應(yīng)隨pH變化Fig.6 Changes of enzymatic reaction in the different pH

2.6.1.3 酶促反應(yīng)隨底物濃度變化 底物濃度在酶活性反應(yīng)中也具有非常重要的作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定5個(gè)底物濃度梯度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，底物濃度為100μmol/L時(shí)，酶活性最高，因此本實(shí)驗(yàn)確定100μmol/L為FOMT活性反應(yīng)的最佳濃度。

因此，酶促反應(yīng)的最適溫度為25℃，最適pH范圍在7.5～8.0，最適底物濃度為100μmol/L。得出FOMT活性反應(yīng)的優(yōu)化體系:Tris－Hcl(7.5)50mmol/L，β－巰基乙醇 14mmol/L，底物 100μmol/L，SAM 40μmol/L，Mg2+12.5mmol/L，25℃水浴反應(yīng)30min，沸水浴5min終止反應(yīng)。

圖7 酶促反應(yīng)隨底物濃度變化Fig.7 Changes of enzymatic reaction on the different substrate concentrations

2.6.2 不同底物樣品FOMT活性測定比較 根據(jù)2.6.1酶活測定體系優(yōu)化的結(jié)果，采取pH 7.5，底物濃度100μmol/L，溫度25℃水浴孵育30min，檢測FOMT活性。圖8為不加類黃酮底物的空白實(shí)驗(yàn)，酶液中SAH含量較低，檢測不到數(shù)值。色譜圖圖9～圖11分別為以槲皮素、山奈酚、異鼠李素為底物的FOMT活性反應(yīng)生成物SAH測定的HPLC圖譜。不同底物樣品FOMT活性測定比較結(jié)果見表1。

圖8 空白實(shí)驗(yàn)(不加類黃酮底物)樣品的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of blank test sample (without flavonoid substrates)

圖9 槲皮素為底物的FOMT活性反應(yīng)生成物SAH色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of SAH derived from FOMT catalytic reaction on the quercetin

表1 三種底物FOMT相對(duì)活性比較(n=3)Table 1 Comparative of FOMT activity on there different substrates(n=3)

由表1可以得出，不同反應(yīng)底物的FOMT活性表現(xiàn)有所差異:山奈酚與異鼠李素差異不顯著，槲皮素分別與山奈酚和異鼠李素都有顯著性差異，槲皮素為底物的酶活性顯著較低。說明FOMT對(duì)山奈酚和異鼠李素的底物親和性顯著高于槲皮素。

圖10 山奈酚為底物的FOMT活性反應(yīng)生成物SAH色譜圖Fig.10 HPLC chromatogram of SAH derived from FOMT catalytic reaction on the kaempferol

圖11 異鼠李素為底物的FOMT活性反應(yīng)生成物SAH色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of SAH derived from FOMT catalytic reaction on the isorhamnetin

3 討論

本研究首次采用HPLC方法測定銀杏葉片中FOMT酶活性，所獲得的HPLC方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，精確度良好，耗費(fèi)藥品較少，節(jié)省成本，可有效測定FOMT活性反應(yīng)產(chǎn)物的含量，從而更加準(zhǔn)確地測出酶的活性。由于酶活反應(yīng)受到反應(yīng)溫度，反應(yīng)濃度，試劑等的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶活反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，使得酶活測定的結(jié)果更具代表性。選擇山奈酚、槲皮素和異鼠李素作為反應(yīng)底物能夠更好地說明FOMT的活性，因?yàn)檫@三種底物是具有生物活性的黃酮苷元，也是GBE質(zhì)量檢測的主要指標(biāo)。本研究為探究銀杏雄株葉片類黃酮含量與FOMT活性相關(guān)性奠定基礎(chǔ)，從而為銀杏優(yōu)質(zhì)葉用資源的選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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Analysis on flavonoid O－methyltransferase activity in Ginkgo by high performance liquid chromatography

ZHONG Yue－ming1，ZHANG Chuan－li2，CHEN Peng1，*，SHEN Dan－h(huán)ong1，WU Qiu－yue1，ZHOU Chang－yuan1
(1.College of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China; 2.College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

To research and geta technique and method fordetermination on theactivityofflavonoid O－methyltransferase(FOMT)，a key－enzyme of flavonoid biosynthesis in Ginkgo leaves，by RP－HPLC for the first time.The adult leaves of male plants，were obtained from Ginkgo germplasm resources garden of Yangzhou university，then that were used to extract the crude enzyme solution.Based on the principle of S－adenosyl－L－h(huán)omocysteine(SAH)derived from FOMT catalytic reaction and the correlationship between content and peak area of SAH，the relative activities of FOMT on the different substrates such as kaempferol，quercetin and isorhamnetin，were determined，the standard curve detected by optimized high performance liquid chromatography(HPLC) system in which there was a significant linear relationship within the range of 1.5～20μg/mL，RSD=2.1%(n=5)，so the optimized system for assaying FOMT activity had been established.FOMT activities of the different substrates showed different，kaempferol and isorhamnetin significiantly higher than quercetin.This HPLC system for determination on FOMT activity could be considered as a method which was accuracy，fastness，reliability and high sensitivity.

Ginkgo;male plant;leaf;flavonoidO－methyltransferase(FOMT)activity;high performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002－0306(2012)08－0095－05

2011－07－20 *通訊聯(lián)系人

仲月明(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:銀杏保健藥用資源的開發(fā)利用。

國家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)項(xiàng)目(GH32311002);江蘇省林業(yè)三項(xiàng)工程項(xiàng)目(lxsx［2008］02)。