周婷婷，楊瑞學(xué)，宋 弋，張玉玉，呂 茜，倪元穎，李全宏，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083; 2.中國農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院，北京100083)

高效液相色譜法測定老陳醋中的5-羥甲基糠醛

周婷婷1，楊瑞學(xué)2，宋 弋1，張玉玉1，呂 茜1，倪元穎1，李全宏1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083; 2.中國農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院，北京100083)

利用高效液相色譜法測定老陳醋中5－羥甲基糠醛(5－HMF)的含量，以5%甲醇水溶液為流動相，采用C18色譜柱，在284nm波長條件下檢測樣品中的5－HMF。結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確，在0.0143～0.1001μg范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.9994，平均回收率88.27%～96.69%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.09%～4.70%。

老陳醋，高效液相色譜，5－羥甲基糠醛

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

三種不同品牌的老陳醋 北京美廉美超市; 5－羥甲基糠醛 純度99%，Sigma公司;甲醇 色譜純，北京愛希姆科技發(fā)展有限公司;0.45μm水系濾膜 藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司。

LC－20A高效液相色譜儀 配有LC－20AT洗脫泵、SPD－20A檢測器、CTO－20A柱溫箱、LC Solution工作站，島津國際貿(mào)易有限公司;Venusil XBP－C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm) 博納艾杰爾科技有限公司;LGJ－12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技公司;2000D型超純水器 北京長風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精確稱取5－羥甲基糠醛(5－HMF)標(biāo)準(zhǔn)品0.0286g，用超純水溶解，定容到100mL的容量瓶中，得到0.286mg/mL的5－HMF標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于4℃條件下避光保存。

1.2.2 樣品溶液的配制 取各種老陳醋樣品50g，冷凍干燥后，取適量用超純水溶解，用0.45μm的水系微孔濾膜過濾后，待HPLC分析。

1.2.3 分析測定條件 色譜條件:Venusil XBP－C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm);柱溫:30℃;UV檢測器，檢測波長:284nm;流動相:甲醇－水(5∶95，v/v);進(jìn)樣量:20μL;流速:1.0mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法

采用冷凍干燥處理老陳醋樣品，去除了揮發(fā)性干擾成分，比直接上樣更準(zhǔn)確，且有利于保護(hù)色譜柱。圖1和圖2分別為老陳醋經(jīng)冷凍干燥進(jìn)樣和直接進(jìn)樣的色譜圖。

圖1 老陳醋經(jīng)冷凍干燥進(jìn)樣測定色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of freeze－dried over mature vinegar sample

圖2 老陳醋直接進(jìn)樣測定色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of over mature vinegar sample by direct injection

2.2 色譜條件優(yōu)化

通過對流動相組分、比例和流速的優(yōu)化，觀察對應(yīng)的色譜峰型和出峰時間，結(jié)果表明，當(dāng)流動相組分為甲醇－水(5∶95，v/v)，等梯度洗脫，流動相流速1mL/min，檢測波長284nm時，5－HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰峰形最好，見圖3。當(dāng)流動相的甲醇的比例高于5%時，出峰時間早，基質(zhì)干擾影響大，不利于實際樣品的測定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

取5－HMF標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用超純水稀釋成質(zhì)量濃度為2.86μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，精密量取5－HMF標(biāo)準(zhǔn)品工作液5、10、15、20、25、30、35μL，經(jīng)優(yōu)化的色譜條件注入液相色譜儀，重復(fù)3次，測定5－HMF峰面積積分值，取3次測定峰面積的平均值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。以峰面積與進(jìn)樣量作線性回歸方程y= 7×106x+3773.1，R2=0.9994，結(jié)果表明，檢測方法在進(jìn)樣量為0.0143～0.1001μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖3 5－HMF標(biāo)樣測定色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 5－HMF standard solution

圖4 5－HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of 5－HMF

2.4 重復(fù)性實驗

取同一老陳醋樣品的測定液，相同體積進(jìn)樣5次，分別按上述色譜條件測定其中5－HMF的含量，計算所測含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.59%(見表1)，說明本方法用于測定老陳醋中5－HMF含量具有較好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 1 The result of repeatability test

2.5 穩(wěn)定性實驗

取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，室溫放置。每1.5h進(jìn)樣1次，測定5次，分別進(jìn)樣20μL。結(jié)果表明，所測含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.86%(見表2)，說明處理后的標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫條件下6h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 2 the result of stability test

2.6 精密度實驗

取上述制備的標(biāo)準(zhǔn)品工作液在上述色譜條件下連續(xù)7次進(jìn)樣，每次20μL。結(jié)果見表3。結(jié)果表明，同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣的RSD為0.19%，說明該方法的精密度較高。

表3 精密度實驗結(jié)果Table 3 The result of precision test

2.7 加樣回收實驗

取同一老陳醋樣品，分為3組，分別加入一定量2.86μg/mL 5－HMF標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按上述色譜條件測定其中5－HMF的含量，計算本方法的回收率(見表4)。表4結(jié)果顯示，3個水平的平均回收率分別為88.27%、96.40%和96.69%，變異系數(shù)為2.09%～4.70%。因此，利用本方法測定老陳醋中的5－HMF含量，靈敏度高，重現(xiàn)性良好。

表4 5－HMF加樣回收率實驗結(jié)果(n=3)Table 4 5－HMF recovery tests and corresponding relative standard deviations(n=3)

2.8 樣品測定

選取市售的3種不同品牌的老陳醋，按1.2.2的實驗條件制備樣品溶液，用高效液相色譜測定5－HMF峰面積，分別代入回歸方程，計算樣品中5－HMF的含量，結(jié)果見表5。

表5 實際樣品中5－HMF含量分析結(jié)果Table 5 Analysis results of 5－HMF contents in samples

檢測結(jié)果表明，所選擇的各品種老陳醋中均含有一定量的5－HMF，不同老陳醋的含量差別較大，這可能與老陳醋的品質(zhì)、工藝和貯存時間的不同有關(guān)。

3 結(jié)論

本方法采用高效液相色譜定量檢測老陳醋中5－HMF的含量。其前處理簡單、易操作，準(zhǔn)確度、精密度均較好，重現(xiàn)性良好。運(yùn)用該方法檢測不同品種的老陳醋中的 5－HMF含量，平均回收率為88.27%～96.69%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.09%～4.70%。由于目前我國尚未制訂老陳醋中5－HMF含量的檢測方法，因而本方法的建立不僅可以為老陳醋標(biāo)準(zhǔn)方法的建立和質(zhì)量的監(jiān)控提供一個有力的參考，也為老陳醋和5－HMF的研究提供一個新的思路。

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Determination of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural (5－HMF)in over mature vinegar by HPLC

ZHOU Ting－ting1，YANG Rui－xue2，SONG Yi1，ZHANG Yu－yu1，LV Qian1，NI Yuan－ying1，LI Quan－h(huán)ong1，*
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China; 2.Chinese Academy of Agricultural Mechanization Sciences，Beijing 100083，China)

A method for the determination of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural by high－performance liquid chromatography in old mature vinegar was developed.Samples were analyzed on a C18column at 284nm using a mixture of methanol and water(5∶95，v/v)as the mobile phase.Within the linear range of 0.0143～0.1001μg，the method was accurate with the range of average recoveries rate and relative standard deviation of 88.27%～96.69%and 2.09%～4.70%，respectively.

old mature vinegar;high－performance liquid chromatography;5－h(huán)ydroxymethylfurfural(5－HMF)

TS207.3

A

1002－0306(2012)08－0083－03

老陳醋是以高粱、麩皮、水為主要原料，以稻殼或谷殼為輔料，以大麥、豌豆為原料所制得的大曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)酒精發(fā)酵后采用醋酸發(fā)酵，再經(jīng)熏醅、“夏伏曬、冬撈冰”陳釀等工藝釀造而成的食醋［1］。在其生產(chǎn)工藝中，熏醅是十分重要的生產(chǎn)工序，它不僅可以增加老陳醋產(chǎn)品適應(yīng)要求的色澤，而且還決定了老陳醋產(chǎn)品的獨(dú)特風(fēng)味［2］，在熏醅過程中發(fā)生的糖降解和美拉德反應(yīng)，都會導(dǎo)致5－羥甲基糠醛的產(chǎn)生。5－羥甲基糠醛(5－Hydroxymethylfurfural，5－羥甲基－2－糠醛，HMF)，是葡萄糖或果糖等單糖化合物在高溫或酸性條件下，催化脫水產(chǎn)生的一種醛類化合物，是美拉德反應(yīng)的重要中間產(chǎn)物［3］，主要存在于可能發(fā)生美拉德反應(yīng)和糖降解反應(yīng)的食品中，如醬油［4］、酒類［5］、蜂蜜［6－7］、烘焙食品［8］、植物油［9］等，其含量是研究食品在加工貯藏過程中質(zhì)量變化以及衡量相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的一項重要指標(biāo)。研究表明，5－羥甲基糠醛具有多方面的生理作用，食用過量可能對人體健康造成傷害［10］。因此，世界各國均對食品中羥甲基糠醛的含量做了限量規(guī)定，一般不得超過20mg/kg［11］。目前，5－羥甲基糠醛含量測定的方法主要有:高效液相色譜法［12］、氣相色譜質(zhì)譜法［13］、紫外分光光度法［14］。近年來，針對啤酒［15］、牛乳［16］、飲料［17］等食品，都已建立了相關(guān)的HPLC測定方法。然而對于老陳醋中5－羥甲基糠醛含量的分析還未見報道。本文采用高效液相色譜法，對老陳醋中的5－羥甲基糠醛進(jìn)行定量測定，建立一種準(zhǔn)確測定老陳醋中5－羥甲基糠醛含量的方法，為研究5－HMF對老陳醋功能及風(fēng)味穩(wěn)定性的影響提供參考。

2011－07－25 *通訊聯(lián)系人

周婷婷(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)。

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD23B01)。