林 霖，蘭全學，祝仁發(fā)，2，楊國武，*

(1.深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳518131; 2.佛山市農業(yè)局，廣東佛山528000)

熒光PCR快速檢測A、C、G群溶血性鏈球菌

林 霖1，蘭全學1，祝仁發(fā)1，2，楊國武1，*

(1.深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳518131; 2.佛山市農業(yè)局，廣東佛山528000)

克服現(xiàn)有文獻中PCR檢測方法僅能檢測蘭氏A群鏈球菌的局限，建立適用于溶血性鏈球菌群全族群的熒光PCR快速檢測方法，實現(xiàn)與國家標準GB/T 4789.11－2003檢測范圍一致。通過文獻搜索以及桿菌肽敏感實驗，對國標檢驗范圍進行界定。使用CLUSTAL X軟件尋找蘭氏A、C、G群保守序列并設計特異性引物和探針，同時通過特異性實驗、模擬污染實驗以及方法比對實驗驗證該方法的特異性、檢出限及可靠性。特異性實驗結果表明，該方法能特異擴增蘭氏A、C、G群鏈球菌;模擬污染實驗表明，在增菌18h后增菌液最低初始污染菌含量分別為3、50、2CFU/mL時，蘭氏A、C、G群鏈球菌可被檢出。110份樣品比對實驗結果表明與國標檢測方法實驗結果一致。該方法可應用于食品中溶血性鏈球菌的快速檢測，并可為快速檢測溶血性鏈球菌國家標準的建立提供參考。

實時熒光PCR，溶血性鏈球菌，檢測，食品

近年來食品安全問題已成為公眾關注的焦點問題，而微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中最為突出的問題。溶血性鏈球菌屬于鏈球菌屬，其廣泛存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫或皮膚、粘膜傷口感染傳播，而被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會使人類感染［1］。關于鏈球菌屬的分類，目前國內外使用最為廣泛的為蘭氏分類法，按菌株的血清學特征將鏈球菌屬進行分類，常見血清型為蘭氏A、B、C、G群等。國家標準GB/T 4789.11－2003對溶血性鏈球菌的檢驗采用傳統(tǒng)的增菌劃線分離鑒定方法，其周期長、步驟繁瑣并且對操作人員經(jīng)驗要求較高，不適宜快速檢測的需求，而近年來興起的實時熒光PCR技術具有簡單、快速、靈敏、準確的特點，適合于食品中致病菌的快速篩查［2］。溶血性鏈球菌在國家標準中規(guī)定為乙型溶血、鏈激酶陽性、桿菌肽陽性的革蘭氏陽性鏈球菌，但未說明所檢測鏈球菌的血清群。在以往的報道中符合革蘭氏陽性球菌、乙型溶血、鏈激酶陽性的鏈球菌包含了蘭氏A、C、G群［3］，但關于桿菌肽陽性鏈球菌包含的血清群則無相關報道。因此本研究通過對鏈球菌屬的幾個代表株進行桿菌肽敏感實驗，對國標檢驗范圍進行了界定，并根據(jù)菌株序列設計特異性擴增引物及探針，建立了符合國家標準檢驗范圍且可同時檢測蘭氏A、C、G群鏈球菌的實時熒光PCR快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準菌株 美國典型菌種保藏中心(ATCC)、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)、國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心、中國藥品生物制品檢定所、中國科學院微生物研究所、廣東微生物所、軍事醫(yī)科院，菌株購買之后使用API鑒定試劑條進行菌株鑒定確認，具體菌株來源信息詳見表1及表2;桿菌肽紙片(紙片直徑6mm、含量為0.04μg/片) 杭州天和微生物試劑有限公司;營養(yǎng)肉湯、葡萄糖肉浸液肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術有限責任公司;血瓊脂平皿 鄭州安圖綠科生物工程有限公司;API鑒定試劑條 法國梅里埃公司;實時熒光PCR反應試劑Premix ExTaq(2×)寶生物工程(大連)有限公司;引物、探針 上海生工生物工程有限公司。

7500實時熒光PCR儀 美國ABI公司;SHP－250恒溫培養(yǎng)箱、DK－8D水浴鍋 上海精宏公司;純水機 美國Millipore公司;Allegra 64R離心機 美國Bekman公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 初始菌懸液制備 待檢菌株用血瓊脂平皿劃線分離，37℃培養(yǎng)18～24h，挑取典型單菌落再劃線接種血瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)18～24h;挑取菌落用滅菌生理鹽水稀釋至0.5麥氏單位濃度，制成初始菌懸液。

1.2.2 桿菌肽敏感實驗 每種待檢菌初始菌懸液取200μL涂布血瓊脂平皿，稍干后每個平皿貼2片桿菌肽紙片，兩紙片距離平皿邊緣和兩紙片間距約30mm，37℃培養(yǎng)24h。記錄出現(xiàn)抑菌圈的菌株。

1.2.3 引物及探針的設計 溶血素S為導致溶血性鏈球菌乙型溶血特征的主要因素［4－6］，于NCBI數(shù)據(jù)庫中下載編碼溶血素S的靶基因序列，其來源于蘭氏A、C、G群鏈球菌的全基因組序列(NC_004070.1，NC_008022.1，NC_003485.1，NC_002737.1，NC_ 007297.1，NC_007296.1，NC_008021.1，NC_008023.1，NC_011375.1，NC_008024.1，NC_011134.1，NC_ 012891.1)。采用CLUSTAL X軟件進行序列比對，在SagA基因中找到了一段僅保守于蘭氏A、C、G群鏈球菌中的特異性序列，共71bp。并在此序列中設計特異性引物及探針，引物序列在NCBI網(wǎng)站Primer－BLAST中進行特異性搜索，而探針序列在NCBI網(wǎng)站nucleotide BLAST中進行特異性搜索，搜索結果均顯示能特異性擴增蘭氏A、C、G群鏈球菌。正向引物序列為:5’－GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA－3’;反向引物序列為:5’－AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA－3’;探針序列為:5’－AAACAACTCAAGTTGC TCCTGGAGG－3’，5’端標記 FAM，3’端標記TAMRA。

1.2.4 實時熒光PCR反應體系及程序 反應體系(20μL):正向引物(20μmol/L)0.4μL，反向引物(20μmol/L)0.4μL，探針(20μmol/L)0.2μL，Premix ExTaq(2×)10μL，滅菌超純水4μL，DNA模板5μL。

反應程序:95℃3min;95℃15s，60℃34s，40個循環(huán)。

結果判斷:Ct值≤35時，可判定檢測結果為陽性;Ct值≥40時，可判定檢測結果為陰性;35＜Ct值＜40時，需適當增加模板量重復擴增，如果得到Ct值≤35，則可判定檢測結果為陽性，否則判定檢測結果為陰性。

1.2.5 水煮法制備模板 取1mL增菌液置于1.5mL離心管中，12000r/min離心10min，去除上清液，收集菌體。加入100μL滅菌超純水，混勻，100℃沸水中水浴10min。12000r/min離心10min，取上清液作為反應模板。

1.2.6 特異性實驗 選取35種常見食源性致病菌(見表2)用營養(yǎng)肉湯增菌，按1.2.5制備模板，按1.2.4進行實時熒光PCR反應和結果判斷。

1.2.7 模擬污染實驗 選取蘭氏A、C、G群鏈球菌代表菌株按照1.2.1進行初始菌懸液制備，制成初始菌懸液菌液濃度10－1～10－8倍的菌懸液;取濃度為10－4～10－6的菌懸液100μL涂布血瓊脂平皿，每個濃度梯度設置兩個平行，37℃培養(yǎng)24h，按GB4789.2－2010進行菌落計數(shù)，并得出原菌液中實際含菌量。按照GB/T4789.11－2003中的方法對牛奶樣品進行檢驗，確認未檢出溶血性鏈球菌后作為模擬污染源。取25mL牛奶樣品至225mL滅菌超純水中混勻制備成樣品稀釋液，取1mL各梯度菌懸液至9mL樣品稀釋液中混勻，再吸取1mL各個污染菌液的樣品稀釋液至9mL葡萄糖肉浸液肉湯培養(yǎng)基中，制備成菌含量分別為101、102、103、104CFU/mL的增菌液并將其置于37℃培養(yǎng)，并分別在培養(yǎng)0、4、8、18h時取出并吸取1mL增菌液按照1.2.5制備模板，并按照1.2.4進行實時熒光PCR反應以及結果判斷。各種菌的各個濃度梯度設置三個重復。

1.2.8 方法比對實驗 將樣品按GB/T4789.11－2003進行樣品稀釋和增菌后，吸取1mL增菌液按照1.2.5制備模板，并按照1.2.4進行實時熒光PCR反應以及結果判斷。同時，將增菌液按國家標準GB/T4789.11－2003進行后續(xù)實驗，并比對結果。

2 結果與分析

2.1 桿菌肽敏感實驗結果

如表1所示，在血瓊脂平皿上顯示出乙型溶血特性以及桿菌肽敏感特性的鏈球菌菌株僅包括蘭氏A、C、G群鏈球菌，由此可以推斷國家標準中規(guī)定的“溶血性鏈球菌”為蘭氏A、C、G群鏈球菌。

2.2 特異性實驗結果

在35種常見食源性致病菌中，所設計的引物和探針能夠特異的對蘭氏A、C、G群鏈球菌進行擴增，擴增結果詳見表2和圖1。

表1 桿菌肽敏感實驗結果Table 1 Results of bacitracin sensitive experiment

圖1 特異性實驗結果圖Fig.1 Specificity of real－time fluorescence PCR assays for the detection of Streptococcus hemolyticus

2.3 模擬污染實驗結果

通過模擬污染實驗，對所設計的引物及探針在蘭氏A、C、G群鏈球菌中的檢出限進行檢測，實驗結果如表3所示。蘭氏A群鏈球菌在增菌18h后在增菌液初始菌含量為3CFU/mL時可檢出;蘭氏C群鏈球菌在增菌18h后在增菌液初始菌含量為50CFU/mL時可檢出;蘭氏G群鏈球菌在增菌18h后在增菌液初始菌含量為2CFU/mL時即可檢出。

2.4 方法比對實驗結果

對110批次樣品進行檢測方法的比對實驗，實驗結果如表4所示，國標檢測方法及實時熒光PCR檢測方法均未在樣品中檢出溶血性鏈球菌，兩種方法的檢測結果完全一致。

表4 樣品比對實驗結果Table 4 Compareing national standards method with real－time fluorescence PCR assaysby detection of Streptococcus hemolyticus in samples

3 討論

過去普遍認為溶血性鏈球菌感染主要由蘭氏A群鏈球菌引起，然而文獻報道表明蘭氏C、G群鏈球菌引起的疾病也不容忽視［7］。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明1975～1995年間英國由蘭氏G群鏈球菌感染導致的疾病出現(xiàn)了顯著增長［8］。而近年來國內外關于蘭氏C、G群鏈球菌引起疾病爆發(fā)的文獻報道也日益增多［9－12］。原因可能由于蘭氏C、G群鏈球菌與蘭氏A群鏈球菌引起的感染癥狀極為相似，因此在以往的鑒定中容易將其誤認為是蘭氏A群鏈球菌感染［7－8，12］。蘭氏C群鏈球菌包括類馬鏈球菌、獸疫鏈球菌和馬鏈球菌，會導致人畜共患病，人類因食用動物源性食品而感染［13］。而蘭氏G群鏈球菌的感染主要是由于乙型溶血的停乳鏈球菌似馬亞種，此菌株在以往被歸入蘭氏C群，而后通過分子分型的手段將其歸為蘭氏G群，其具有A、C、G三種血清型抗原，并且其感染引起的癥狀與蘭氏A群鏈球菌極為相似［7－8，13］。

表2 特異性實驗結果Table 2 Results of specificity detecting by real－time fluorescence PCR assays

表3 模擬污染實驗結果Table 3 Result of simulated contamination experiment detecting by real－time fluorescence PCR assays

溶血性鏈球菌的致病因子主要包括溶血素、鏈激酶、M蛋白等。對引起疾病爆發(fā)的菌株進行分析發(fā)現(xiàn)，蘭氏A群鏈球菌99%的菌株編碼M蛋白，但蘭氏C、G群則只有大約50%的菌株編碼M蛋白［8］。鏈激酶雖然在蘭氏A、C、G群鏈球菌中均有編碼，但C、G群的鏈激酶等位基因與A群的有較大差別，蘭氏C、G群鏈球菌中也僅有2個共有等位基因［14］。因此M蛋白和鏈激酶的編碼基因均無法作為同時檢驗蘭氏A、C、G群鏈球菌的靶基因位點。乙型溶血是溶血性鏈球菌的重要致病因子，鏈球菌中存在三種溶血素，即溶血素O、溶血素S和溶血素β－h(huán)/c，溶血素O具有抗原性，但對氧不穩(wěn)定;溶血素β－h(huán)/c是導致B群溶血性鏈球菌乙型溶血特征的主要因素;溶血素S則特異存在于A、C、G群溶血性鏈球菌中，其是一種小分子多肽，不具有抗原性，但對氧穩(wěn)定，是導致A、C、G群溶血性鏈球菌乙型溶血特征的主要因素［4－6］。溶血素S由30個氨基酸組成，其分子量為2.8ku，由SagA－I 9個基因協(xié)同表達，SagA為結構基因，SagB－I為調控基因［6］。通過序列比對軟件，比對編碼溶血素S的基因序列，在SagA基因序列中找到一段僅保守于蘭氏A、C、G群鏈球菌的特異性序列，在該特異性序列上設計引物及探針，經(jīng)過熒光PCR反應，可以實現(xiàn)同時檢驗蘭氏A、C、G群鏈球菌。

該方法可在檢出培養(yǎng)18h的蘭氏A、C、G群鏈球菌，其增菌液的最低初始菌含量分別為3、50、2CFU/ mL。其中蘭氏A、G群檢出限相似，這是由于其靶基因序列之間的相似度較蘭氏C群高，導致引物對其擴增效率較蘭氏C群高引起的。這也與文獻中描述的蘭氏G群與蘭氏A群序列相似度極高一致［7－8，13］。

目前國內外文獻報道的溶血性鏈球菌檢驗方法中，有對其培養(yǎng)基進行改進的，但依然限制于傳統(tǒng)劃線分離方法［15］;也有采用實時熒光PCR技術的，但是其檢測范圍僅限制于蘭氏A群鏈球菌［16－17］;也有采用LAMP技術的，雖然該方法快速簡便，但由于設計引物位點包含6個保守區(qū)域，特異性極高，也僅限制于蘭氏A群鏈球菌［18］。鑒于國標檢驗范圍包含了蘭氏A、C、G群鏈球菌，因此不宜采用。而本次研究建立的以SagA為靶基因的實時熒光PCR檢測方法，實時熒光PCR整個實驗過程僅需1h，大大縮短了檢驗時間，并且其操作簡便、靈敏度高，可應用于實際檢測中。此方法的建立也可為國家標準的修訂提供參考。

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Rapid detection of group A，C and G Streptococcus hemolyticus by using real－time fluorescence PCR assays

LIN Lin1，LAN Quan－xue1，ZHU Ren－fa1，2，YANG Guo－wu1，*
(1.Shenzhen Academy of Metrology Quality Inspection，Shenzhen 518131，China; 2.Foshan Municipal Agriculture Bureau，F(xiàn)oshan 528000，China)

In order to beyond the limits that current real－time PCR method could only detect group A Streptococcus，a new method was established using real－time fluorescence PCR assays with detection range consistent to the national standard GB/T4789.11－2003.Bacitracin sensitive experiment was used to validate the detection range of Streptococcus hemolyticus in the national standard GB/T4789.11.Group A，C and G Streptococcus were selected and the DNA sequences of which were aligned using CLUSTAL X software. Conserved region of DNA sequences was used for the designing of primers and taqman probe.Method using real－time fluorescence PCR assays was constructed.The specificity，sensitivity and accuracy of this method were tested.Sensitivity experiment demonstrated that the new method could successfully distinguish the group A，C and G Streptococcus serotype from non－group A，C and G Streptococcus and other serotype.Simulated contamination experiment showed that after 18h culture at least 3，50 and 2CFU/mL of group A，C and G Streptococcus respectively could be tested by the new method from the enrichment broth.Accuracy test experiment was performed and completely same result was found either using the new method or national standard methods.This real－time fluorescence PCR assays could be used to rapid detection of Streptococcus hemolyticus in food，and might provide the reference for the national standards revision.

real－time PCR;Streptococcus hemolyticus;detection;food

TS207.4

A

1002－0306(2012)08－0078－05

2011－07－28 *通訊聯(lián)系人

林霖(1987－)，女，碩士，研究方向:食品生物化學。

國家質檢總局科技計劃項目(2008QK272)。