隋志偉，王 晶，*，李 亮，謝田法

(1.中國計量科學(xué)研究院，北京100013;2.北京工業(yè)大學(xué)，北京100124)

轉(zhuǎn)基因植物REAL-TIME PCR方法檢出限和定量限的研究

隋志偉1，王 晶1，*，李 亮1，謝田法2

(1.中國計量科學(xué)研究院，北京100013;2.北京工業(yè)大學(xué)，北京100124)

目前Real－time PCR(Rt－PCR)方法在轉(zhuǎn)基因植物定量檢測中應(yīng)用最為廣泛。有關(guān)該方法的檢出限和定量限的計算并沒有達(dá)成統(tǒng)一。本文采用統(tǒng)計模型對三種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行實時熒光定量PCR方法檢出限和定量限的研究。實驗結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因玉米NK603檢出限5拷貝，定量限14拷貝;轉(zhuǎn)基因棉花Mon15985檢出限5拷貝，定量限12拷貝;轉(zhuǎn)基因油菜Oxy235檢出限4拷貝，定量限9拷貝。是利用統(tǒng)計學(xué)方法對轉(zhuǎn)基因植物熒光定量PCR方法檢出限和定量限研究的一個積極嘗試，可用于其他轉(zhuǎn)基因植物檢測中檢出限和定量限的確定。

轉(zhuǎn)基因植物，檢出限，定量限，統(tǒng)計容忍限

近年來，隨著基因工程技術(shù)越來越多地應(yīng)用于農(nóng)作物改良，轉(zhuǎn)基因作物逐漸在全世界范圍內(nèi)發(fā)展起來。轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍的迅猛發(fā)展也使其食用安全和環(huán)境安全問題引起了各國政府和相關(guān)國際組織的高度重視。紛紛出臺的轉(zhuǎn)基因生物安全管理相應(yīng)的法規(guī)對轉(zhuǎn)基因生物從生產(chǎn)到上市的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)范和監(jiān)控［1］。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測不但需要定性，還需要準(zhǔn)確定量。目前采用Rt－PCR是轉(zhuǎn)基因植物檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，確定此方法的檢出限和定量限顯得尤為重要。截止1995年，國際上出現(xiàn)了大量關(guān)于檢出限和定量限這方面的概念。就檢出限而言，不同術(shù)語的確切含義也有一定的差異。如有的是用統(tǒng)計的語言描述的;有的則是從檢出實踐出發(fā)，更多的是用文字描述的。即使同樣用統(tǒng)計語言來表述，它們也有差別。如有的只考慮第一類錯誤，有的同時考慮兩類錯誤(即假陽性和假陰性)。為了更好地指導(dǎo)實踐，有些國際組織分別制定了有關(guān)的文件或標(biāo)準(zhǔn)［2－3］。但是，這些文件中的概念并不統(tǒng)一，給實際使用人員帶來很大的不便，同時也不利于國際交流。為此，1995年經(jīng)國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)有關(guān)人員共同商議，由IUPAC和ISO分別頒布統(tǒng)一的術(shù)語用于國際化學(xué)和計量委員會 (internationalchemicaland metrological communities)等。盡管如此，有關(guān)檢出限的計算問題并沒有達(dá)成統(tǒng)一。ISO11843給出的檢出限計算是基于區(qū)間估計的方法，而美國材料測試協(xié)會采用的是容忍區(qū)間的辦法。美國環(huán)保署在對純凈水的有關(guān)檢測中，考察了IUPAC等提出的方法，并在此基礎(chǔ)上給出了單一實驗室的檢出限和定量限的評定辦法［4］。本文將統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因植物檢測中，以期利用異方差線性回收模型和相關(guān)實驗對三種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行實時熒光定量PCR方法檢出限和定量限方面的研究。

表1 熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)化體引物和探針序列信息Table 1 Primer and probe sequences for real－time PCR detection of transformants

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物基因組提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;轉(zhuǎn)基因植物純陽基體樣品 本實驗室保存;轉(zhuǎn)基因植物各轉(zhuǎn)化體的內(nèi)標(biāo)外源引物探針(見表1) 由上海英駿公司合成;ddH2O Millipore。

振蕩器 IKA;離心機(jī) Sigma;AB7900熒光定量PCR儀，熒光分析儀(Fluoroskan Ascent)。

1.2 確定檢出限和定量限的統(tǒng)計模型和方法

下面基于美國材料測試協(xié)會的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［5－6］簡要介紹其中確定檢出限和定量限的核心思想。設(shè)在給定的真實濃度T下，實際測定結(jié)果Y滿足:Y=a+ bT+ε·G(T)，其中ε:N(0，1)，稱該模型為線性平均回收(mean recovery，MR)模型。現(xiàn)有的檢測實踐中，為了實際處理的方便，常常人為假定誤差方差為常數(shù)，然而大多數(shù)情形下這樣的假定不成立。此時，若仍采用常數(shù)方差模型就會對計算的結(jié)果造成很大的偏差。因此，有必要考慮測量數(shù)據(jù)的散布即方差依賴于濃度水平的情況，即異方差模型。

對標(biāo)準(zhǔn)差G(T)建模后，需要估計MR模型中的未知參數(shù)。注意，為了簡便起見，G(T)的估計我們僅考慮常數(shù)、線性、指數(shù)和混合四種模型［5］。所以，如果是常數(shù)模型，則a，b的估計用普通最小二乘，否則，得用加權(quán)最小二乘。設(shè)其估計為^a，b^。

1.2.2 定量限的確定方法 誤差標(biāo)準(zhǔn)差G(T)的擬合和建模同上。

Z%的LOQ記為LOQZ%，它的含義是在該濃度水平下，任一測定值具有Z%的相對標(biāo)準(zhǔn)差。Z一般取10、20、30，從小到大依次取，只要計算出的LOQZ%值沒超出測定值的范圍，則選用它作為定量限。否則，需要考慮使用部分?jǐn)?shù)據(jù)或者是增加新的數(shù)據(jù)。計算方法如下，注意到LOQZ%滿足T=100/ZG(T)，在不同的G(T)表達(dá)式下解出T即可。

1.2.3 實時熒光定量PCR方法分析

1.2.3.1 樣品DNA的提取 稱取100mg樣品，按照植物基因組提取試劑盒說明書提取樣品DNA。

表5 轉(zhuǎn)基因油菜Oxy235內(nèi)/外源基因PCR反應(yīng)體系Table 5 The PCR reaction system of endogenous gene/exogenous gene in genetically modified canola Oxy235

1.2.3.2 樣品DNA的質(zhì)量檢查 a.紫外分光光度法檢測提取DNA純度。將DNA適當(dāng)稀釋，測定并記錄其在260nm和280nm的紫外光吸收率即A260和A280，用A260/A280來計算DNA的純度(見表2)，當(dāng)純度范圍在1.8～2.0之間說明樣品DNA質(zhì)量滿足實驗要求。對轉(zhuǎn)基因植物純陽基體樣品提取DNA和進(jìn)行紫外檢測結(jié)果顯示比值都處在1.8與2.0之間，結(jié)果表明提取的DNA質(zhì)量很好地滿足了定量PCR的要求。

b.熒光染料法測定DNA濃度。本方法采用熒光染料P7589能特異性的結(jié)合雙鏈DNA，因此可以特異性測定雙鏈DNA的濃度，受單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)的影響較小。具體操作步驟如下:

試劑的稀釋:用ddH2O將原TE溶液(20×)稀釋20倍，配制成1×TE溶液;用1×TE將原標(biāo)準(zhǔn)DNA(100μg/mL)稀釋成2μg/mL;用1×TE將試劑盒中的染料P7589稀釋200倍。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:打開熒光分析儀預(yù)熱15min后，測定96孔點樣孔板的本底熒光信號;用1×TE將標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液(2μg/mL)進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后與染料P7589溶液等體積混合，振蕩混勻，將標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液稀釋成1000、100、10、1和0ng/mL;在點樣板上每孔上樣 200μL，以熒光分析儀 Fluoroskan Ascent測定樣品的熒光信號(選擇濾鏡對 EX: 485nm;EM:538nm);將樣品熒光信號扣除點樣板本底熒光信號后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.1 Establishment of calibration curve

樣品DNA純度測定:熒光分析器儀器預(yù)熱15min后，測定96孔點樣孔板的本底熒光信號;以1 ×TE將待測樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋100倍后與染料P7589溶液等體積混合，振蕩混勻;在點樣板上每孔上樣200μL，測定其熒光信號(選擇濾鏡對EX:485nm;EM:538nm)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品DNA濃度。

經(jīng)過實驗結(jié)果表明，我們所提取的DNA模板濃度見表2，可以滿足實時熒光定量PCR檢測需要。

表2 三種轉(zhuǎn)化體提取的基因組DNA純度和濃度Table 2 The purity and concentration of genomic DNA extracted from three transformants

1.2.3.3 各轉(zhuǎn)基因植物Rt－PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 轉(zhuǎn)基因植物Rt－PCR反應(yīng)體系因轉(zhuǎn)化體不同而異，三種轉(zhuǎn)基因植物的Rt－PCR反應(yīng)體系分別見表3～表5。各轉(zhuǎn)化體的反應(yīng)條件參數(shù)均相同，詳見表6。

表3 轉(zhuǎn)基因玉米NK603內(nèi)/外源基因PCR反應(yīng)體系Table 3 The PCR reaction system of endogenous gene/exogenous gene in genetically modified corn NK603

表4 轉(zhuǎn)基因棉花Mon15985內(nèi)/外源基因PCR反應(yīng)體系Table 4 The PCR reaction system of endogenous gene/exogenous gene in genetically modified cotton Mon15985

表7 轉(zhuǎn)基因玉米NK603的Rt－PCR結(jié)果Table 7 Rt－PCR result of genetically modified corn NK603

表8 轉(zhuǎn)基因棉花Mon15985的Rt－PCR結(jié)果Table 8 Rt－PCR result of genetically modified cotton Mon15985

表9 轉(zhuǎn)基因油菜Oxy235的Rt－PCR結(jié)果Table 9 Rt－PCR result of genetically modified canola Oxy235

表6 Rt－PCR反應(yīng)程序Table 6 Rt－PCR reaction program

1.2.3.4 DNA模板的稀釋 將各轉(zhuǎn)化體DNA模板進(jìn)行系列稀釋(見表7～表9)，每個濃度水平作6個重復(fù)，直到檢測不到信號為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 各轉(zhuǎn)基因植物熒光定量PCR結(jié)果

將各轉(zhuǎn)基因植物的純陽基體作系列稀釋進(jìn)行Rt－PCR反應(yīng)，分別作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，直至當(dāng)模板到某一濃度檢測不到信號為止，詳細(xì)結(jié)果見表7～表9。

2.2 各轉(zhuǎn)基因植物Rt－PCR反應(yīng)檢出限和定量限結(jié)果

根據(jù)實驗設(shè)計所得出的各轉(zhuǎn)基因植物Rt－PCR反應(yīng)的測定數(shù)據(jù)，按照本文1.2的統(tǒng)計模型和方法計算得到各轉(zhuǎn)基因植物Rt－PCR反應(yīng)檢出限和定量限結(jié)果，詳見表10。

表10 各轉(zhuǎn)化體Rt－PCR反應(yīng)檢出限和定量限結(jié)果Table 10 The results of LOD and LOQ in various transformants

2.3 討論

隨著近年來轉(zhuǎn)基因植物的研究不斷升溫，有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物檢測的重要性也日漸凸顯，目前實時熒光定量PCR是公認(rèn)用于轉(zhuǎn)基因植物檢測的首選檢測方法，過去人們常常從樣品檢出數(shù)據(jù)來確定Rt－PCR方法檢出限和定量限，由于不同儀器、不同實驗操作者以及不同實驗批次之間的差別，得出的檢出限和定量限數(shù)據(jù)往往差別比較大，而應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)模型得出的檢出限和定量限數(shù)據(jù)相對科學(xué)可靠。已有文獻(xiàn)報道使用統(tǒng)計學(xué)方法推斷熒光定量 PCR檢測限的［7］，目前多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并沒有應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物檢測的相關(guān)文獻(xiàn)。本文選用美國材料測試協(xié)會的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)給出的基于統(tǒng)計學(xué)的方法，ISO11843給出的方法主要是基于線性或非線性校準(zhǔn)情形。傳統(tǒng)的3σ和10σ的方法僅適用于常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差情形，這在實際中往往很少滿足。而ASTM6091和6512給出的方法則考慮了包括常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差在內(nèi)的四個備選模型，因而其適用范圍最廣。同時確定選擇方法時應(yīng)考慮的一些原則(如可操作性、實施費(fèi)用等);其次，對基因檢測數(shù)據(jù)的特點進(jìn)行詳細(xì)的分析(包括正確性、精密度和不確定度及統(tǒng)計分析等);然后，確定適用于基因檢測方法的檢出限和定量限的計算方法，并就選擇的方法設(shè)計合理的水平(即選擇測試多少個不同水平，這些水平怎么確定等)。最后，對所選的方法進(jìn)行一定的驗證，以說明合理性。通過以上的研究工作，在實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計基礎(chǔ)上，我們得出三種轉(zhuǎn)基因植物Rt－PCR反應(yīng)檢出限和定量限結(jié)果分別為:轉(zhuǎn)基因玉米NK603檢出限5拷貝，定量限14拷貝;轉(zhuǎn)基因棉花Mon15985檢出限5拷貝，定量限12拷貝;轉(zhuǎn)基因油菜Oxy235檢出限4拷貝，定量限9拷貝。

本文研究建立的轉(zhuǎn)基因植物實時熒光定量PCR反應(yīng)檢出限和定量限確定方法，是利用統(tǒng)計學(xué)方法對轉(zhuǎn)基因植物熒光定量PCR反應(yīng)檢出限和定量限研究的一個積極嘗試，可用于其他轉(zhuǎn)基因植物檢測中檢出限和定量限的確定，并通過在今后其他轉(zhuǎn)基因植物檢測中的應(yīng)用而使該方法得到不斷的完善。

［1］鄧漢超，尹長城，劉國振，等.轉(zhuǎn)基因植物核酸成分檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2011，31(1):86－95.

［2］FreiserH，NancollasGH.Compendium ofanalytical nomenclature［M］.1sted.Oxford:Wiley－Blackwell，1978.

［3］Wilrich P，ISO 11843－2－2000，Capability of Detection［S］. USA:ISO/TC69/SC6，ISO，2000.

［4］EPA，Revised assessment of detection and quantitation approaches［R］.EPA，2004.http://www.epa.gov/waterscience/ methods/det/faca/techworkgroup/

［5］ASTM D6091－07.Standardpracticefor99%/95% interlaboratory detection estimate(IDE)for analytical methods with negligible calibration error［S］.USA:ASTM，2007.

［6］ASTM D6512－07.Standard practice for interlaboratory quantitation estimate［S］.USA:ASTM，2007.

［7］王文清，王昌富，袁琳，等.實時熒光定量PCR檢測限的統(tǒng)計推斷［J］.實用醫(yī)技雜志，2007，14(11):1382－1383.

Study on limit of detection and limit of quantification of Real－time fluorescence quantitative PCR in gene modified plant

SUI Zhi－wei1，WANG Jing1，*，LI Liang1，XIE Tian－fa2
(1.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China; 2.Beijing University of Technology，Beijing 100124，China)

At present，Real－time PCR(Rt－PCR)is the most widely used in the quantitative detection of gene modified plant.Calculation of the limit of detection(LOD)and limit of quantification(LOQ)in this method was not obtained consistency.The LOD and LOQ of real－time fluorescence quantitative PCR in three kinds of gene modified plants were studied by statistical model.The results showed that LOD and LOQ of transgenic maize NK603 were 5 copies and 14 copies，respectively.LOD and LOQ of transgenic cotton Mon15985 were 5 copies and 12 copies，respectively.LOD and LOQ of transgenic canola Oxy235 were 4 copies and 9 copies，respectively.An active try on LOD and LOQ of transgenic plant was studied by statistical method，which could be used to determine the LOD and LOQ of other gene modified plants.

gene modified plant;limit of detection(LOD);limit of quantification(LOQ);statistical tolerance limits

TS207

A

1002－0306(2012)08－0059－05

2011－07－15 *通訊聯(lián)系人

隋志偉(1980－)，男，博士，助理研究員，主要從事微生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因植物等生物計量方面的研究。

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2008ZX08012003);國家科技支撐計劃(2008BAK41B01)。