吳少云，蘇健裕，石 磊，，李 琳

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

梅片樹葉揮發(fā)油和天然右旋龍腦的抑菌性能研究

吳少云1，蘇健裕2，*，石 磊1，2，李 琳2

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

目的：研究梅片樹葉揮發(fā)油、天然右旋龍腦的體外抗菌性能。方法：采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法測定梅片樹葉揮發(fā)油、天然右旋龍腦和合成龍腦對細(xì)菌、植物病原真菌和動物源真菌的抑菌圈大小，并采用瓊脂稀釋法測定其最小抑菌濃度（MIC值）。結(jié)果：梅片樹葉揮發(fā)油、天然右旋龍腦和合成龍腦有不同程度的抑菌作用，天然右旋龍腦和合成龍腦抑菌作用相似，梅片樹葉揮發(fā)油的抑菌效果比較明顯。結(jié)論：梅片樹葉揮發(fā)油和天然右旋龍腦均有一定的抑菌活性，具有廣闊的開發(fā)利用前景。

梅片樹葉揮發(fā)油，天然右旋龍腦，抑菌性能

龍腦是一種高級香料和重要的化工原料，按來源不同可以分為3種[1]：左旋龍腦（L-borneol），俗稱艾片，主要是從菊科多年生草本植物艾納香（Blumea balsamifera DC.）葉提取的結(jié)晶；天然右旋龍腦（D-borneol），又稱梅片、天然冰片，主要來源于龍腦香科植物龍腦香樹（Dryobalanops aromatica Gaertn.f.）樹脂中析出的天然結(jié)晶性化合物；合成龍腦，俗稱“機(jī)制冰片”，是由松節(jié)油、樟腦等經(jīng)化學(xué)方法合成，是消旋龍腦和異龍腦的混合物。近年研究表明合成龍腦的質(zhì)量不穩(wěn)定[2]，某些在售產(chǎn)品中含有毒性樟腦的相對含量可達(dá)45%以上，有的甚至達(dá)到97%，而且主要成分可隨儲藏時間延長而發(fā)生變化[3]。所以，天然右旋龍腦逐步取代合成龍腦是必然的趨勢[4]。天然右旋龍腦原產(chǎn)于印度尼西亞蘇門答臘群島，它是從龍腦香樹干的樹脂蒸餾而得的天然產(chǎn)品，我國一直以來依靠進(jìn)口滿足需要[5]。但是目前由于當(dāng)?shù)亻L期以來過度采伐，自然資源破壞嚴(yán)重，該地龍腦香樹已近枯竭；加之當(dāng)?shù)卣呀?jīng)禁止伐樹取腦，天然右旋龍腦奇缺，我國已經(jīng)不可能依靠進(jìn)口來滿足需要，對整個中醫(yī)藥行業(yè)造成了嚴(yán)重的影響[6-7]。20世紀(jì)80年代，中國科學(xué)院華南植物研究所在廣東梅州地區(qū)的樟科陰香化學(xué)型—梅片樹枝葉中提取得到了天然右旋龍腦[7-8]。本文作者利用GC-MS分析對梅片樹枝葉龍腦粗油成分進(jìn)行了首次分析，共獲得了40種成分，其中天然右旋龍腦相對含量達(dá)到了78.4%[9]。然而，目前尚未對梅片樹葉提取物的抗菌活性進(jìn)行研究報道。本文通過對梅片樹葉揮發(fā)油及從揮發(fā)油結(jié)晶的天然右旋龍腦進(jìn)行體外抗菌研究，以期對梅片樹的應(yīng)用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

梅片樹葉揮發(fā)油 從梅片樹葉中提取得到；天然右旋龍腦 從梅片樹揮發(fā)油中升華結(jié)晶得到，廣東嘉應(yīng)制藥股份有限公司；合成龍腦 廣州黃埔化工有限公司；慶大霉素藥敏紙片（10μg/片） 北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；硫酸慶大霉素（Sigma分裝） 北京普博欣生物科技有限公司；二甲基亞砜、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MHA）、沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDB）、腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂 廣州國奧生物技術(shù)有限公司；氯化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）ATCC29213，銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）ATCC27853，沙門氏菌（Salmonella）ATCC14128，單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115，大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922，白色念珠菌（Moniliaalbican）ATCC11006 由河北省疾控中心提供；植物病原真菌：水稻稻瘟病菌（Pyricu laria oryzae Cav.），松赤枯病菌（Pesta lotia funereal），玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kuha） 由中國科學(xué)院華南植物研究所惠贈；動物源真菌：須毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes），犬小孢子菌（Microsporum canis），石膏小孢子菌（Microsporum gypseum） 由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所惠贈。

1.2 實驗方法

1.2.1 梅片樹葉揮發(fā)油的提取[9]將新鮮梅片樹葉粉碎，按《中國藥典》（2005版）附錄XD的水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。收集蒸餾的餾出物，向其中投入過量無水硫酸鈉并充分振蕩。使用循環(huán)水式真空泵抽濾此混合物得到不含水分的龍腦粗油（黃色透明油狀物）。

1.2.2 菌懸液的制備 挑取1～2個菌落于生理鹽水，校正至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度（該管為0.048mol/L的BaCl2，即150g/L BaCl20.5mL加0.18mmol/L H2SO499.5mL，相當(dāng)于10cfu/mL）。

1.2.3 抗菌藥物的配制

1.2.3.1 慶大霉素的配制 用無菌水溶解慶大霉素并配制藥品濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL 6個濃度。

1.2.3.2 天然右旋龍腦和合成龍腦的配制（測抑菌圈）分別用100%DMSO 1mL溶解1.5g天然右旋龍腦和合成龍腦，混勻成透明狀，備用。（測MIC值）用100%DMSO分別溶解天然右旋龍腦和合成龍腦并配制藥品濃度為50、40、30、20、15、10、5、2.5mg/mL 8個濃度。

1.2.3.3 揮發(fā)油的配制 用100%DMSO稀釋揮發(fā)油，濃度為16%、8%、4%、2%、1%、0.5%6個濃度。

1.2.4 K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法抑菌實驗[10]將菌懸液0.1mL滴入培養(yǎng)基（細(xì)菌采用MHA、植物病原真菌采用SDA、動物源真菌采用PDB）涂布均勻即成含菌平板，加蓋室溫下放置3min。將10μL龍腦、10μL合成龍腦、10μL揮發(fā)油、10μL DMSO、10μL無菌水分別滴加在6mm的濾紙片上，在無菌條件下將其貼在各種含菌平板上，并貼上慶大霉素藥敏紙片作為對照。15min內(nèi)將平板放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取出平板，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，實驗重復(fù)三次。

1.2.5 最小抑菌濃度（MinimalInhibitionConcentration，MIC）的測定（瓊脂稀釋法）[10]分別吸取上述8個濃度的天然右旋龍腦、合成龍腦和6個濃度的揮發(fā)油、慶大霉素藥液2mL于培養(yǎng)皿中，每皿再加入18mL培養(yǎng)基，搖勻，靜置凝固后，每皿分別點上三類菌懸液各2μL。并以不加藥液的平板和含有10%DMSO的平板點上菌液作為對照。待菌液干后將平板放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h，以不長菌的藥品最低濃度為該藥品的MIC值，實驗重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈大小的測定

三類菌株的抑菌圈測定結(jié)果見表1。從結(jié)果可看出，天然右旋龍腦和合成龍腦的抑菌效果相似，對單增李斯特菌和沙門氏菌的抑菌作用均不明顯，但對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和白色念珠菌有一定的抑菌效果，抑菌活性由強(qiáng)到弱依次為：白色念珠菌>大腸桿菌>銅綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>單增李斯特菌。梅片樹葉揮發(fā)油對各供試菌株均有一定的抑制作用，對白色念珠菌和大腸桿菌的抑菌效果較顯著?？傮w而言，揮發(fā)油比龍腦的抑菌效果要顯著些。

天然右旋龍腦和合成龍腦對植物病原真菌和動物源真菌的6種菌均有一定的抑菌作用，梅片樹葉揮發(fā)油對這6種菌的抑制作用也比較顯著。由前期研究可知，揮發(fā)油中除了龍腦外還含有其它成分具有抑菌作用，如乙酸龍腦酯（3.26%）、斯巴醇（2.60%）和桉葉油素（1.92%）等[8]。倪木蘭等[11]研究表明桉葉油對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用。

2.2 MIC值的測定

三類菌株的MIC值測定結(jié)果見表2，兩個對照平板均長菌，天然右旋龍腦、合成龍腦和梅片樹葉揮發(fā)油對三類菌株均有抑菌作用。揮發(fā)油的MIC值比天然右旋龍腦和合成龍腦小，表明其抑菌作用較為明顯。此外，天然右旋龍腦和合成龍腦對植物病原真菌和動物源真菌的MIC值均比細(xì)菌的大，而梅片樹葉揮發(fā)油基本保持不變，表明天然右旋龍腦和合成龍腦抑制細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng)，揮發(fā)油由于含有多種成分而保持較為廣譜的抑菌性能。

表1 三類菌株的抑菌圈大?。╩m）Table 1 The inhibition zone of three kinds of strains（mm）

表2 三類菌株的MIC值的測定Table 2 Determination of MIC of three kinds of strains

3 結(jié)論

本實驗通過采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法測定梅片樹葉揮發(fā)油、天然右旋龍腦和合成龍腦對細(xì)菌、植物病原真菌和動物源真菌的抑菌圈大小，并采用瓊脂稀釋法測定最小抑菌濃度，以比較梅片樹葉揮發(fā)油、天然右旋龍腦和合成龍腦的體外抗菌活性。以上結(jié)果表明，天然右旋龍腦、合成龍腦和梅片樹揮發(fā)油對細(xì)菌、植物病原真菌、動物源真菌均有一定的抑菌作用，尤其是對白色念珠菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。天然右旋龍腦和合成龍腦有相似的抑菌效果，但天然右旋龍腦的無毒性與穩(wěn)定性使其具有更廣闊的潛在應(yīng)用前景；梅片樹葉揮發(fā)油由于含有多種成分而具有更加廣譜的抑菌作用，是一種很有研究價值和開發(fā)前景的芳香油植物資源。

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[2]曾池清，何貴峰.十批市售冰片的GC-MS分析[J].中藥材，2004，27（5）：347.

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[11]倪木蘭.桉葉油體外抗菌作用的初步實驗研究[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，18（3）：178-180.

Study on antibacterial activity of essential oil and D-borneol from leaves of Cinnamomun burmannii B1

WU Shao-yun1，SU Jian-yu2，*，SHI Lei1，2，LI Lin2
（1.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

To investigate the antibacterial function of essential oil and D-borneol from leaves of Cinnamomun burmannii B1 in vitro.The K-B disc agar diffusion method was used to mensurate the size of antibacterial zone of essential oil and D-borneol from leaves of Cinnamomun burmannii B1，as well as synthetic borneol.The agar dilution method was used to determine their minimum inhibitory concentrations（MIC）.Essential oil，D-borneol and synthetic borneol had different level of inhibitory effect.D-borneol and synthetic borneol had similar inhibitory effect，and the antibacterial effect of essential oil was more significant.Essential oil and D-borneol showed antibacterial effects on the experimental strains，which exhibited a promising prospect for developing medical products and perfume.

essential oil from Cinnamomun burmannii B1 leaves；D-borneol；antibacterial effect

TS201.2

A

1002-0306（2012）07-0085-03

2011－06－29 *通訊聯(lián)系人

吳少云（1987-），女，碩士研究生，研究方向：病原微生物學(xué)。

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項目（10451064101005160）；省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項目（2009A090100041，2010B090500033）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金（2011ZM0099）。